本發明專利技術公開了一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli-SL26的構建方法，本方法采用Red/ET系統同源重組敲除嘌呤核苷磷酸化酶基因，在四環素（Tet）和卡那霉素（Kam）雙重抗性下篩選到了嘌呤核苷磷酸化酶基因成功敲除的菌株Eocli-SL26。本發明專利技術成功沉默了肌苷水解為次黃嘌呤的途徑，提高了酶催化的轉化率和5`-磷酸化肌苷的純度，降低了肌苷的損耗和生產成本，有利于后續5`-磷酸化肌苷的提取和殘余肌苷的套用，該發明專利技術對酶催化肌苷5`-磷酸化的產業化進程具有重要意義。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26的構建方法。
技術介紹
核苷酸作為重要的食品添加劑和藥物中間體而被業界廣泛關注并研發，其中 5' -肌苷酸鈉(5' -1MP)和5' -鳥苷酸鈉(5' -GMP)具有濃烈的鮮味，是新一代雞精調味品的主要原料，而3'-肌苷酸鈉和2'-肌苷酸鈉鮮味則基本沒有鮮味(周秀芹，2010)。當前， 以肌苷和鳥苷為原料加上合適磷酸供體，采用化學法和酶法催化都可以獲得5'-肌苷酸和 5'_鳥苷酸，然而由于酶法具有催化條件溫和、專一性較強、對環境友好、特異性高等特點 (Asano 和 MIhara 等，1999;崔桂友，2003 ;宋勇波和儲炬等，2003 ；Kuninaka, 1960 )，而受到國內外科研人員和產業界的廣泛關注，發展迅速。其中，日本味之素公司已采用酶催化技術生產呈味核苷酸，韓國希杰則利用發酵直接產肌苷酸和鳥苷酸。希望能夠充分利用酸性磷酸酶這一催化特性(ZHANG Chong和XING Xinhui等，2005)，以期開發出高效生產呈味核苷酸的酶工程技術。酸性磷酸化酶在大腸桿菌表達之后，催化過程會表現出一定程度降解肌苷成次黃嘌呤，影響了肌苷的轉化率，對后續的提取過程中肌苷的套用增加了難度。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的不足，提供一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26的構建方法，用于阻斷肌苷轉變為次黃嘌呤。嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)是嘌呤補救合成途徑的關鍵酶之一，廣泛存在于原核和真核生物中(Bzowska和Kulikowska等,2000 )。該是一種戍糖基轉移酶,催化嘌呤核苷與正磷酸作用生成自由嘌呤及核糖-5-磷酸的反應。 為了實現上述目的，本專利技術提供一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26的構建方法，為敲除其嘌呤核苷磷酸化酶基因(purine nucleoside phosphorylase,簡稱PNP),本專利技術利用Red/ET系統同源重組,在四環素(Tet)和卡那霉素 (Kam)雙重抗性下篩選嘌呤核苷磷酸化酶基因成功敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26，沉默肌苷水解為次黃嘌呤的途徑，提高磷酸轉移酶的轉化率。一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecol1-SL26的構建方法，包括如下步驟(I)通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因，設計引物PCR擴增得到同源重組缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以驗證宿主中PNP的存在；所述引物為PNP-upper:5’ -TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3’ ；PNP-1ower: 5， -CGGATGTGGTCAGATACGGT-3，；(2)通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因及其上下游基因的同源性情況，根據 K006-Ecol1-Gene Deletion Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，擴增得到在Red/ET系統同源重組中的功能片段；所述功能段擴征的引物為deoD_FRT_f 5’-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAA CCCTCACTAAAGGGCG ；deoD-FRT-r 5’-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATAC GACTCACTATAGGGCTC ；(3)制備宿主的感受態細胞，電轉質粒pRedET，幫助功能片段同源重組(4)阿拉伯糖誘導含有pRedET的感受態宿主后，電轉化線性的功能片段；(5)在pRedET質粒的幫助下，功能片段與染色體基因組上的PNP進行同源重組(6)電轉化表達質粒706-F1P，幫助消除同源整合到染色體上的抗性標記(7)通過溫度變化，消除抗性標記以及丟失表達質粒706-F1P。在上述構建方法中，在該方法中用于重組和缺失抗性標記的兩個質粒pRedET和 706-FLP 均為 K006-Ecol1-Gene Deletion Kit 提供。在上述構建方法中，步驟(3)是采用Eppendorf_Electroporator2510電轉儀,在 1350V下進行電轉。在上述構建方法中，構建過程所用的培養基均為LB，培養溫度在30_37°C，pH在 6. 0_7· O ο 與現有技術相比，本專利技術具有以下有益的效果1、本專利技術通過Red/ET系統同源重組的方式成功敲除了 PNP基因，提高了酶催化的轉化率和5' -磷酸化肌苷的純度，降低了肌苷的損耗和生產成本，有利于后續5' -磷酸化肌苷的提取和殘余肌苷的套用，該專利技術對酶催化肌苷5'-磷酸化產業化進程的推進具有重要意義。2、本專利技術運用Red/ET系統同源重組缺失PNP，該方法可以完全鏤掉PNP基因，在基因組中不會殘留抗性標記，與傳統意義的插入失活具有本質的不同。3、經改造后的工程菌，其催化反應液在后續的提取更加簡單，有利于肌苷的回收套用。4、經改造后的工程菌，簡化了提取工藝，更進一步的推進了酶法肌苷磷酸化的產業化進程。附圖說明圖1 為 PNP 的 PCR 圖2為含有同源的功能片段的PCR圖3為敲除后的催化液體的高效液相色譜圖。具體的實施方式實施例1 驗證表達磷酸轉移酶大腸桿菌是否含有磷酸化轉移酶以大腸桿菌菌懸液為模板，利用以下引物進行菌落PCR初步驗證PNP的存在PNP-upper: 5’ -TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3’PNP-1ower: 5’ -CGGATGTGGTCAGATACGGT-3’PCR 反應條件為變性 940C，2min ;解鏈 94°C，Imin ;退火 63 °C，Imin ;延伸 72 °C， lmin30s ;進行30個循環擴增,擴增后72°C延伸lOmin。實施例2同源重組缺失嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因1、擴增含有同源臂的功能PCR片段，利用引物deoD--f5’-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAAC A j^f^ACCCTCACTAAAGGGCG|deoD- (FRlj ~r 5’-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAA | Α ATA C G AC TC A CTATA GGGCTC如圖1所示。PCR 反應條件為變性 940C，2min ;解鏈 94°C，Imin ;退火 65 °C，Imin ;延伸 72 °C， 2min50s ;進行30個循環擴增,擴增后72°C延伸lOmin。 2、缺失嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的目標菌株篩選I)感受態制備，轉化pRedET。挑取單克隆，過夜培養后，在2°C，IlOOOrpm下離心l-3min,去上清,用Iml預冷的ddH20重懸沉淀,重復以上步驟一次,去上清,殘余的20_30μ1 溶解沉淀即為制備好的感受態細胞，加入 μ PRedET質粒到菌體中，小心混勻后將菌體轉移至預冷的電轉杯中，在1350v進行電轉，30°C培養2-3h后涂平板，至含Tet抗性(終濃度 3 Pg/ml)的LB培養液(lml本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大腸桿菌Ecoli?SL26的構建方法，其特征在于包括如下步驟：（1）通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因，設計引物PCR擴增得到同源重組缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以驗證宿主中PNP的存在；所述引物為：PNP?upper:?5’?TTTTGATGCCAGGCGACCCG?3’；PNP?lower:?5’?CGGATGTGGTCAGATACGGT?3’；（2）通過NCBI查找大腸桿菌PNP基因及其上下游基因的同源性情況，根據K006?Ecoli?Gene?Deletion?Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，擴增得到在Red/ET系統同源重組中的功能片段；所述功能段擴征的引物為：deoD?FRT?f：5“?CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG；deoD?FRT?r：5“?AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATACGACTCACTATAGGGCTC；（3）制備宿主的感受態細胞，電轉質粒pRedET，幫助功能片段同源重組：（4）阿拉伯糖誘導含有pRedET的感受態宿主后，電轉化線性的功能片段；（5）在pRedET質粒的幫助下，功能片段與染色體基因組上的PNP進行同源重組：（6）電轉化表達質粒706?FlP，幫助消除同源整合到染色體上的抗性標記：（7）通過溫度變化，消除抗性標記以及丟失表達質粒706?FlP。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡友華，鄭明英，嚴杰能，陸最青，
申請(專利權)人：廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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