尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的表達(dá)及酶活測(cè)定制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的表達(dá)及酶活測(cè)定。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)人將PL啟動(dòng)子、大腸桿菌UDP-GlcDH的基因(ugd)串聯(lián)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，將所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核菌株，利用該菌株溫度誘導(dǎo)表達(dá)UDP-GlcDH，并對(duì)其酶活性進(jìn)行測(cè)定。采用該表達(dá)方法得到的UDP-GlcDH，表達(dá)效率高，酶活性高，酶活性保持的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物工程領(lǐng)域；更具體地，本專(zhuān)利技術(shù)涉及通過(guò)采用基因工程方法克隆并表達(dá)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶(Uridine Diphosphate Glucose Dehydrogenase,UDP-GlcDH)。
技術(shù)介紹
透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid,HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖與葡萄糖醛酸為雙糖單位等摩爾聚合而成的酸性黏多糖，Mr多在IO4 IO7Da之間，不同的Mr具有不同的應(yīng)用領(lǐng)域。由于HA獨(dú)特的黏彈性和生理功能，HA已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域。C組的獸疫鏈球菌和馬疫鏈球菌都可以合成HA，鑒于HA在發(fā)酵液中以游離狀態(tài)存在，具有易于分離純化和工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此目前工業(yè)上主要采取發(fā)酵法獲取HA。然而鏈球菌具有一定的致病性并含有外毒素，而且對(duì)于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件要求苛刻，利用它發(fā)酵生產(chǎn)難于通過(guò)代謝調(diào)控獲得不同分子量的HA等劣勢(shì)已展現(xiàn)出來(lái)，以傳統(tǒng)的工藝優(yōu)化難以克服上述弊端，而采用基因工程手段構(gòu)建工程菌表達(dá)HA則克服了上述缺點(diǎn)，具有成本低，便于代謝調(diào)控以及下游純化工藝便捷等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為未來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)HA的優(yōu)選方法。研究表明，鏈球菌中的has操縱子是其表達(dá)合成HA所必需的，has操縱子是由hasA、hasB和hasC三個(gè)基因組成,分別編碼著HA合成酶、尿苷二磷酸_葡萄糖脫氫酶和尿苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶，但是對(duì)于HA合成代謝具有顯著影響的主要是hasA和hasB基因，只要將hasA與hasB基因?qū)氡磉_(dá)菌株并在適宜的培養(yǎng)條件下就有可能獲得HA。UDP-GlcDH存在于動(dòng)物、植物與細(xì)菌中，可以將尿苷二磷酸-葡萄糖轉(zhuǎn)化成尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸，后者是形成結(jié)構(gòu)多糖和細(xì)胞生長(zhǎng)代謝必不缺少的前體物質(zhì)。Sheng等研究結(jié)果表明高表達(dá)UDP-GlcDH更有利于HA的生成，因此只有提供豐富的HA前體物質(zhì)——尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸才能高表達(dá)HA，而高表達(dá)的UDP-GlcDH則是產(chǎn)生大量尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸的必需條件。因此，本領(lǐng)域非常有必要研究高表達(dá)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的方法，以大量生產(chǎn)透明質(zhì)酸。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供大腸桿菌尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的表達(dá)及酶活測(cè)定。在本專(zhuān)利技術(shù)的第一方面，提供一種重組表達(dá)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的方法，包括(I)提供表達(dá)構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件噬菌體匕啟動(dòng)子，編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd ；(2)將(I)的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行升溫誘導(dǎo)表達(dá)，迅速升溫到38_42°C，振蕩培養(yǎng)8-15小時(shí)；較佳地為9-12小時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(2)中，升溫誘導(dǎo)表達(dá)方法選自迅速升溫到40-42 °C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)；迅速升溫到40_42°C誘導(dǎo)1±0. 5小時(shí)后迅速降溫至38±0. 5°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)；或添加終濃度為O. 5-2g/L酵母抽提物后迅速升溫到42 ±O. 5°C誘導(dǎo)1±0. 5小時(shí)后迅速降溫至38±0. 5°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)。在另一優(yōu)選例中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，在升溫誘導(dǎo)表達(dá)前，還包括先將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基中，在37±0. 5°C，200r/min培養(yǎng)12±2小時(shí)；之后轉(zhuǎn)接到M9CAA培養(yǎng)基中，在30±O. 5°C,200r/min培養(yǎng)12±2小時(shí)；再次轉(zhuǎn)接到M9CAA培養(yǎng)基中，在35±O. 5°C,200r/min 培養(yǎng) 2±O. 5 小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd的核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)之后，還包括步驟(3):在pH7. 5±0. I條件下測(cè)定誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的酶活。在另一優(yōu)選例中，測(cè)定酶活的方法包括將大腸桿菌培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行菌體破碎(較佳地，采用超聲破碎)，之后在30°C下進(jìn)行酶活反應(yīng)，相對(duì)于Iml酶反應(yīng)體系包括5mmol .!/1UDP-葡萄糖,5mmol · L4NAD+, IOOmmol · L^1Tris-HCl 及 5 μ I 酶液；酶活反應(yīng)后，測(cè)定340nm吸光度，根據(jù)朗波爾定律Λ A= ε CL和酶活定義獲得酶活值。在本專(zhuān)利技術(shù)的另一方面，提供一種用于重組表達(dá)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶(UDP-GlcDH)的構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件噬菌體啟動(dòng)子，編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd的序列如SEQID NO: I 所示。 在另一優(yōu)選例中，編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因Ugd來(lái)源于Escherichiacoli YK537 的基因組 DNA。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體。在本專(zhuān)利技術(shù)的另一方面，提供一種基因工程菌，其包含所述的構(gòu)建物。本專(zhuān)利技術(shù)的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。附圖說(shuō)明圖I、表達(dá)質(zhì)粒pBLBugd和pBLYugd的構(gòu)建示意圖。圖2、不同誘導(dǎo)溫度及培養(yǎng)條件下UDP-GlcDH的活性測(cè)定圖。附圖中的宿主菌均為YK537，+線為質(zhì)粒pBLBugd轉(zhuǎn)化YK537后所得的工程菌測(cè)定的酶活曲線，+線為pBLYugd轉(zhuǎn)化YK537后所得工程菌測(cè)定的酶活曲線。具體實(shí)施例方式本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種大腸桿菌尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶(簡(jiǎn)稱(chēng)UDP-GlcDH)的基因克隆、表達(dá)以及酶活性測(cè)定的方法。本專(zhuān)利技術(shù)將啟動(dòng)子、大腸桿菌UDP-GlcDH的基因(ugd)串聯(lián)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，將所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核菌株，利用該菌株溫度誘導(dǎo)表達(dá)m)P-GlcDH，并對(duì)其酶活性進(jìn)行測(cè)定。采用該表達(dá)方法得到的m)P-GlcDH，表達(dá)效率高，酶活性高，酶活性保持的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。術(shù)語(yǔ)如本文所用，所述的“表達(dá)構(gòu)建物(或稱(chēng)DNA構(gòu)建物)”或“表達(dá)構(gòu)建體(或稱(chēng)DNA構(gòu)建體)”指一種已經(jīng)通過(guò)人為干預(yù)修飾，使其含有按照自然界中不存在的序列所組合和排列的DNA片段的單鏈或者雙鏈DNA分子。如本文所用，所述的“操作性連接”或“可操作性相連”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動(dòng)子區(qū)被置于相對(duì)于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，所述的“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)域”，代表本領(lǐng)域所共知的含義，表示一個(gè)基因的一部分，其含有可供RNA聚合酶結(jié)合的DNA序列和轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)。·如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”;“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。表達(dá)構(gòu)建物本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種用于重組表達(dá)大腸桿菌UDP-GlcDH構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件噬菌體Pl啟動(dòng)子，編碼UDP-GlcDH的基因ugd。作為本專(zhuān)利技術(shù)的優(yōu)選方式，所述的編碼大腸桿菌UDP-GlcDH的基因Ugd序列如SEQID NO: I所示，并且來(lái)源于Escherichia coli YK537的基因組DNA。構(gòu)建物中各元件之間還可包括限制性的酶切位點(diǎn)，這樣有利于各元件的有機(jī)連接。作為本專(zhuān)利技術(shù)的優(yōu)選方式，所述的ugd基因的下游具有限制性內(nèi)切酶HindIII酶切位點(diǎn)。通常，所述的構(gòu)建物位于表達(dá)載體上。因此，本專(zhuān)利技術(shù)還本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種重組表達(dá)尿苷二磷酸？葡萄糖脫氫酶的方法，包括：(1)提供表達(dá)構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件：噬菌體PL啟動(dòng)子，編碼尿苷二磷酸？葡萄糖脫氫酶的基因ugd；(2)將(1)的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行升溫誘導(dǎo)表達(dá)，迅速升溫到38？42℃，振蕩培養(yǎng)8？15小時(shí)。

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：錢(qián)悅，侯永泰，吳劍英，陳奕涵，甘人寶，周慶瑋，榮紹豐，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：上海昊海生物科技股份有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：