一種定量測定植物1, 5-二磷酸核酮糖再生能力的方法技術

本發(fā)明專利技術公開了一種定量測定植物1,5?二磷酸核酮糖再生能力的方法。它包括以下步驟：選第二、第三和第四完全展開葉，無損測定其凈光合速率，取上述三個葉片的平均值代表該株植物的凈光合速率PN；隨后，即刻取上述已測過凈光合速率的葉片各一片，剪碎充分混合，取其中0.1g進行酶液的提取；分別測定提取的酶液中以單位體積單位時間吸光度變化值表示的磷酸果糖激酶活力和葡萄糖?6?磷酸脫氫酶的酶活力，依據公式計算出糖代謝中的磷酸戊糖途徑所占的份額，然后再與植物葉片的凈光合速率相乘，則可獲得植物1,5?二磷酸核酮糖再生能力。本發(fā)明專利技術能快速定量不同環(huán)境下植物1,5?二磷酸核酮糖再生能力，步驟少，計算簡單，測定結果具有可比性以及可靠性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種定量測定植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力的方法，屬于生物生理生化領域。
技術介紹
生物在受到脅迫的情況下，往往因為氣孔關閉而使光合作用受到影響，其中重要的原因是因為卡爾文循環(huán)對1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)的再生能力下降所致。這時，磷酸戊糖途徑能通過生成核糖-5-磷酸進入到卡爾文循環(huán)，通過磷酸化生成RuBP，從而對卡爾文循環(huán)進行物質補充，使植物在脅迫條件下光合作用的進行得到一定程度的補充。在研究植物光合作用時，光合速率是用于表示光合作用強弱的一種表示法，又稱“光合強度”。光合速率的大小可用單位時間、單位葉面積所吸收的二氧化碳或釋放的氧氣表示，亦可用單位時間、單位葉面積所積累的干物質量表示。而凈光合速率(PN)是指光合作用產生的糖類減去呼吸作用消耗的糖類(即凈光合作用產生的糖類)的速率，總光合速率是指光合作用產生糖類的速率，凈光合作用＝總光合作用﹣呼吸作用消耗，能夠直接體現植物的光合效果。磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)，葡萄糖氧化分解的一種方式。由于此途徑是由6-磷酸葡萄糖(G-6-P)開始，故亦稱為己糖磷酸旁路。磷酸戊糖途徑可分成氧化階段和還原階段兩個部分，氧化階段產生的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或還原型輔酶II(NADPH)和還原階段產生的核糖-5-磷酸在植物對抗脅迫環(huán)境時都具有極其重要的作用，核糖-5-磷酸能通過進入卡爾文循化對RuBP形成補充從而使植物在脅迫條件下光合作用能夠得以維持。以往常常研究磷酸戊糖途徑時，很少注意到其在脅迫條件下對植物光合作用維持的重要作用，更沒有方法用于定量測定植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種定量測定植物1,5-二磷酸核酮糖再生 能力的方法，以克服現有技術難以定量反映光合作用的維持能力的弱點。本專利技術采取以下技術方案：一種定量測定植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力的方法，它包括以下步驟：第一，選第二、第三和第四完全展開葉，無損測定其凈光合速率，取上述三個葉片的平均值代表該株植物的凈光合速率PN；第二，隨后，即刻取上述已測過凈光合速率的葉片各一片，剪碎充分混合，取其中0.1g進行酶液的提取；第三，測定上述提取的酶液中以單位體積單位時間吸光度變化值表示的磷酸果糖激酶活力EApfk；第四，測定上述提取的酶液中以單位體積單位時間吸光度變化值表示的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh；第五，將磷酸果糖激酶的酶活力EApfk與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pd累加獲得糖代謝關鍵酶的總活性EA∑，計算公式為EA∑＝EApfk+EAg6pdh；第六，依據葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh和糖代謝關鍵酶的總活性EA∑，計算出糖代謝中的磷酸戊糖途徑份額PPPP；計算公式為PPPP＝EAg6pdh/EA∑；第七，依據糖代謝中的磷酸戊糖途徑份額PPPP乘以植物的凈光合速率PN，計算出植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力RCRuBP，計算公式為RCRuBP＝PPPP×PN。在第一步驟中，測定凈光合速率的時間固定于下午的15:00-16:00，避開植物可能產生午休現象的時間；設置標準測定條件，測定光照強度為300μmol m–2s–1PPFD，溫度設置為25℃，CO2濃度設置為400μmol mol–1。在第二步驟中，酶液的提取方法為：取葉片組織放置于冰浴研缽中，加入液氮進行冷凍研磨，待液氮揮發(fā)后，加入酶提取液；把研磨后的勻漿移入離心管中，離心，取上清液冷藏待測；其中酶提取液為HEPES Tris-HCl，MgCl2，EDTA，二硫蘇糖醇和苯甲基磺酰氟。在第三步驟中，酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EApfk的測定方法為：磷酸果糖激酶的酶活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力。在第四步驟中，酶液中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh的測定方法為：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力等于G6PDH和6PGDH總酶活力減去6PGDH酶活力。在第六步驟中，糖代謝中的磷酸戊糖途徑份額以百分比值來進行體現。所述的HEPES為4-羥乙基哌嗪乙磺酸，Tris-HCl為鹽酸三羥甲基氨基甲烷，EDTA為乙二胺四乙酸。ATP-PFK酶活力的測定方法如下，把酶提取液加入到ATP-PFK酶活分析液中，利用紫外分光光度計在340nm處測定反應混合液中的吸光度的變化D1；ATP-PFK酶活分析液pH 7.8，包括HEPES Tris-HCl、MgCl2、NADH、果糖-6-磷酸、醛縮酶、丙糖磷酸異構酶、3-磷酸甘油脫氫酶和ATP，所述的PFK為磷酸果糖激酶，ATP為三磷酸腺苷，NADH為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型輔酶I。PPi-PFK酶活力的測定方法如下:把酶提取液加入到PPi-PFK酶活分析液中，利用紫外分光光度計在340nm處測定反應混合液中5min的吸光度的變化D2；PPi-PFK酶活分析液pH 7.8，包括HEPES Tris-HCl、MgCl2、NADH，、果糖-6-磷酸、醛縮酶、丙糖磷酸異構酶、3-磷酸甘油脫氫酶和PPi；酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EApfk可表示為D1+D2；所述的PFK為磷酸果糖激酶，PPi為焦磷酸，NADH為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型輔酶I。測定G6PDH和6PGDH的總活力的方法為：把酶提取液加入到G6PDH和6PGDH總酶活分析液中，利用紫外分光光度計在340nm處測定反應混合液中5min的吸光度的變化DT；G6PDH和6PGDH總酶活分析液pH 7.8，包括HEPES Tris-HCl、MgCl2、6-磷酸葡萄糖酸脂二鈉鹽、6-磷酸葡萄糖酸脂和NADPNa2；6PGDH的酶活力的測定方法：把酶提取液加入到6PGDH酶活分析液中，利用紫外分光光度計在340nm處測定反應混合液中5min的吸光度的變化DP；6PGDH酶活分析液pH 7.8，包括HEPES Tris-HCl、MgCl2、6-磷酸葡萄糖酸脂和NADPNa2；酶液中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh可表示為DT-DP；所述的G6PDH為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，6PGDH為6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，NADPNa2為氧化型型輔酶II二鈉鹽。本專利技術的優(yōu)點如下：1)能快速定量不同環(huán)境下植物對卡爾文循環(huán)中1,5-二磷酸核酮糖的再生能力，測定結果具有可比性。2)由于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或還原型輔酶II(NADPH)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型輔酶I(NADH)在340nm的毫摩爾消光系數均為6.22mM-1cm-1，測出的磷酸果糖激酶的酶活力和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力量綱相同，一個單位的葡萄糖通過糖酵解途徑消耗2個單位的NADH，而通過磷酸戊糖途徑恰好生成2個單位的NADPH，因此，用磷酸果糖激酶的酶 活力和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力代表兩個途徑無需歸一化，計算出的糖代謝中的糖酵解途徑份額以及糖代謝中的磷酸戊糖途徑份額穩(wěn)定可靠。3)本方法無需測定酶液中的蛋白質濃度，步驟少，計算簡單。4)剛已完全展開的植物葉片，為同時需要核糖-5-磷酸和NADPH時期，它的磷酸戊糖途徑主要用于1,5-二磷酸核酮糖的再生，一個單位的葡萄糖通過磷酸戊糖途徑可生成2個本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種定量測定植物1,5?二磷酸核酮糖再生能力的方法，其特征在于：它包括以下步驟：第一，選第二、第三和第四完全展開葉，無損測定其凈光合速率，取上述三個葉片的平均值代表該株植物的凈光合速率PN；第二，隨后，即刻取上述已測過凈光合速率的葉片各一片，剪碎充分混合，進行酶液的提取；第三，測定上述提取的酶液中以單位體積單位時間吸光度變化值表示的磷酸果糖激酶活力EApfk；第四，測定上述提取的酶液中以單位體積單位時間吸光度變化值表示的葡萄糖?6?磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh；第五，將磷酸果糖激酶的酶活力EApfk與葡萄糖?6?磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh累加獲得糖代謝關鍵酶的總活性EA∑，計算公式為EA∑＝EApfk+EAg6pdh；第六，依據葡萄糖?6?磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh和糖代謝關鍵酶的總活性EA∑，計算出糖代謝中的磷酸戊糖途徑份額PPPP；計算公式為PPPP＝EAg6pdh/EA∑；第七，依據糖代謝中的磷酸戊糖途徑份額PPPP乘以植物的凈光合速率PN，計算出植物1,5?二磷酸核酮糖再生能力RCRuBP，計算公式為RCRuBP＝PPPP×PN。

【技術特征摘要】
1.一種定量測定植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力的方法，其特征在于：它包括以下步驟：第一，選第二、第三和第四完全展開葉，無損測定其凈光合速率，取上述三個葉片的平均值代表該株植物的凈光合速率PN；第二，隨后，即刻取上述已測過凈光合速率的葉片各一片，剪碎充分混合，進行酶液的提取；第三，測定上述提取的酶液中以單位體積單位時間吸光度變化值表示的磷酸果糖激酶活力EApfk；第四，測定上述提取的酶液中以單位體積單位時間吸光度變化值表示的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh；第五，將磷酸果糖激酶的酶活力EApfk與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh累加獲得糖代謝關鍵酶的總活性EA∑，計算公式為EA∑＝EApfk+EAg6pdh；第六，依據葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh和糖代謝關鍵酶的總活性EA∑，計算出糖代謝中的磷酸戊糖途徑份額PPPP；計算公式為PPPP＝EAg6pdh/EA∑；第七，依據糖代謝中的磷酸戊糖途徑份額PPPP乘以植物的凈光合速率PN，計算出植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力RCRuBP，計算公式為RCRuBP＝PPPP×PN。2.根據權利要求1所述的一種定量測定植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力，其特征在于：在第一步驟中，測定凈光合速率的時間固定于下午的15:00-16:00，避開植物可能產生午休現象的時間；設置標準測定條件，測定光照強度為300μmol m–2s–1PPFD，溫度設置為25℃，CO2濃度設置為400μmol mol–1。3.根據權利要求1所述的一種定量測定植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力，其特征在于：在第二步驟中，酶液的提取方法為：取葉片組織放置于冰浴研缽中，加入液氮進行冷凍研磨，待液氮揮發(fā)后，加入酶提取液；把研磨后的勻漿移入離心管中，離心，取上清液冷藏待測；其中酶提取液為HEPES Tris-HCl，MgCl2，EDTA，二硫蘇糖醇和苯甲基磺酰氟。4.根據權利要求1所述的一種定量測定植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力，其特征在于：在第三步驟中，酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EApfk的測定方法為：磷酸果糖激酶的酶活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力。5.根據權利要求1所述的一種定量測定植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力，其特征在于：在第四步驟中，酶液中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力EAg6pdh的測定方法為：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活力等于G6PDH和6PGDH總酶活力減去6PGDH酶活力。6.根據權利要求1所述的一種定量測定植物1,5-二磷酸核酮糖再生能力，其特征...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：吳沿友，姚凱，饒森，張開艷，陸葉，趙麗華，王瑞，杭紅濤，李海濤，劉叢強，
申請(專利權)人：中國科學院地球化學研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：貴州;52