一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變熒光PCR熔解曲線檢測試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變熒光PCR熔解曲線檢測試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒在兩管PCR體系中即可完成16個(gè)位點(diǎn)16種突變的檢測，PCR擴(kuò)增結(jié)束經(jīng)一次熒光PCR熔解曲線分析就可知道樣本基因型，整個(gè)操作在2～3小時(shí)即可完成，操作步驟少，耗時(shí)短，通量高，且檢測位點(diǎn)多，突變覆蓋率高；此外本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒采用均相檢測、閉管操作，減少了PCR產(chǎn)物污染的可能性，且檢測特異性高，結(jié)果容易判讀。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種應(yīng)用熒光PCR熔解曲線分析檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變的試劑盒。
技術(shù)介紹
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥(G6PD deficiency)是最常見的人類酶缺陷病之一，其病因是G6H)基因突變導(dǎo)致葡萄糖-6-磷酸脫氫酶合成減少。然而，絕大部分患者的生活質(zhì)量并沒有因此降低，這主要是由于在我國出現(xiàn)的絕大部分Gero缺乏癥患者只有在誘因的存在下才會出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀，因此，完全可以通過預(yù)先防范和及時(shí)接受正確的治療而有效的避免上述情況的發(fā)生。所以在我國Gero缺乏癥的高發(fā)區(qū)進(jìn)行全民篩查是十分必要的。目前G6H)缺乏癥的臨床診斷方法包括生化檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法，其中生化篩查是傳統(tǒng)診斷方法，通過直接或者間接地測定G6ro的酶活性來篩查G6ro缺乏癥的攜帶者和患者。主要包括進(jìn)行定性檢測的高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)、熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)、硝基四氮唑藍(lán)(NBT)紙片法和進(jìn)行定量檢測的NBT定量法、NADPH定量比值法等。分子生物學(xué)方法是基于DNA的分析進(jìn)行G6H)基因突變的檢測，如反向點(diǎn)雜交(RDB)、PE/DHPLC、AS-PCR、PCR-SSCP、基因芯片等。生產(chǎn)廠家主要有杭州紐羅西敏生物科技有限公司和Solgent有限公司等。國內(nèi)臨床常用的方法為檢測酶活性的生化檢測法和反向點(diǎn)雜交法。生化檢測方法雖然檢測成本低、檢測時(shí)間短，但其存在以下缺點(diǎn):(I)對女性雜合子的檢出率低，僅為2(T45%左右；(2)結(jié)果易受實(shí)驗(yàn)條件，操作人員等因素影響。 現(xiàn)有的分子檢測方法雖然能較好地解決Gero缺乏癥女性雜合子檢測的問題，但是不同的方法有著自身的局限性。反向點(diǎn)雜交法是一種異相的突變檢測方法，需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)處理，操作步驟較多，容易引起污染，并且結(jié)果判讀易受主觀因素影響。PE/DHPLC對儀器要求設(shè)備高，應(yīng)用性不強(qiáng)。AS-PCR檢測的通量十分有限，而且需要PCR后處理，容易出現(xiàn)污染造成假陽性結(jié)果的發(fā)生。PCR-SSCP對實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，只能檢測突變是否存在，對于突變的具體位置和類型還需要進(jìn)一步的測序。此外，由于某些點(diǎn)突變類型對單鏈DNA的空間構(gòu)象改變小，容易漏檢。基因芯片技術(shù)不但成本高、操作復(fù)雜而且結(jié)果存在不同程度的假陽性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種應(yīng)用熒光PCR熔解曲線分析檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變的試劑盒。本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下:一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變熒光PCR熔解曲線檢測試劑盒，該試劑盒包括:特異擴(kuò)增五種突變位點(diǎn)c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T 和c.1388G>A所在序列的上游引物Fl和下游引物R1，其中，F(xiàn)l的堿基序列如SEQ ID NO:1所示，Rl的堿基序列如SEQ ID NO:2所示；特異擴(kuò)增三種突變位點(diǎn)c.871G>A、c.10040A和c.10240T所在序列的上游引物F2和下游引物R2，其中，F(xiàn)2的堿基序列如SEQ ID NO:3所示，R2的堿基序列如SEQ ID NO:4所示；特異擴(kuò)增突變位點(diǎn)c.95A>G所在序列的上游引物F3和下游引物R3其中，F(xiàn)3的堿基序列如SEQ ID NO:5所不，R3的喊基序列如SEQ ID NO:6所不；特異擴(kuò)增兩種突變位點(diǎn)c.383T>C和c.392G>T所在序列的上游引物F4和下游引物R4，其中，F(xiàn)4的喊基序列如SEQ ID NO:7所不，R4的喊基序列如SEQ ID NO:8所不；特異擴(kuò)增五種突變位點(diǎn)c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T 和 c.592C>T 所在序列的上游引物F5和下游引物R5，其中，F(xiàn)5的堿基序列如SEQ ID NO:9所示，R5的堿基序列如SEQ ID NO:10所示；以及用于檢測上述十六種突變位點(diǎn)的熒光探針。在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述熒光探針包括:用于檢測突變位點(diǎn)c.13600T的熒光探針Pl，其堿基序列如SEQ ID NO: 11所示；用于檢測突變位點(diǎn)c.871G>A的熒光探針P2，其堿基序列如SEQ ID NO:12所示；用于檢測突變位點(diǎn)c.1004C>A和c.10240T的熒光探針P3，其堿基序列如SEQ IDNO:13所示；用于檢測突變位點(diǎn)c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A 和 c.1387C>A 的熒光探針P4，其喊基序列如SEQ ID NO:14所不；用于檢測突變位點(diǎn)c.95A>G的熒光探針P5，其堿基序列如SEQ ID NO:15所示；用于檢測突變位點(diǎn)c.383T>C和c.392G>T的熒光探針P6，其堿基序列如SEQ IDNO:16所示；用于檢測突變位點(diǎn)c.487G>A和c.493A>G的熒光探針P7，其堿基序列如SEQ IDNO:17所示；用于檢測突變位點(diǎn)c.517T>C和c.519C>T的熒光探針P8，其堿基序列如SEQ IDNO:18所示；用于檢測突變位點(diǎn)c.592C>T的熒光探針P9，其堿基序列如SEQ ID NO:19所示。在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述熒光探針5’端的熒光基團(tuán)包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold540、JOE、HEX、CAL Flour0range560、TAMRA、Cal FluorRed590、R0X、CAL Fluor Red610、TEXASRED、CAL Flour Red635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar705，所述熒光探針3’端的淬滅基團(tuán)包括DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該試劑盒包括檢測體系A(chǔ)和檢測體系B，所述檢測體系A(chǔ) 包括:1 XPCR buffer、IU Taq DNA 聚合酶、200 ii MdNTP、2.5mMMgCl2、上游引物FU F2各lpmo l、下游引物RU R2各5pmol及熒光探針PU P2、P3、P4各5pmol ；所述檢測體系B 包括 IXPCR bufferUU Taq DNA 聚合酶、200 ii M dNTP,2.5mMMgCl2、上游引物F3、F4、F5各lpmol、下游引物R3、R4、R5各5pmol及熒光探針P5、P6、P7、P8、P9 各 5pmol ；上述IXPCR buffer 中包括:Tris_HCl pH8.510mM、KC150mM 和 50% (v/v)甘油。在本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述檢測體系A(chǔ)和檢測體系B的熒光PCR熔解曲線檢測程序如下:(I) 50°C 2min,95°C IOmin(2)95°C 15s — 65°C 56°C 15s — 76°C 20s, 10 個(gè)循環(huán)，其中 65°C 56°C 15s 每個(gè)循環(huán)下降rc ；(3)95°C 15s — 55°C 15s — 76°C 20s, 50個(gè)循環(huán)，在55°C退火階段采集熒光信號；(4)95°C Imin — 35°C 3min — 40°C 85°C，其中 本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種葡萄糖?6?磷酸脫氫酶基因突變熒光PCR熔解曲線檢測試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括：特異擴(kuò)增五種突變位點(diǎn)c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T和c.1388G>A所在序列的上游引物F1和下游引物R1，其中，F(xiàn)1的堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示，R1的堿基序列如SEQ?ID?NO：2所示；特異擴(kuò)增三種突變位點(diǎn)c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T所在序列的上游引物F2和下游引物R2，其中，F(xiàn)2的堿基序列如SEQ?ID?NO：3所示，R2的堿基序列如SEQ?ID?NO：4所示；特異擴(kuò)增突變位點(diǎn)c.95A>G所在序列的上游引物F3和下游引物R3其中，F(xiàn)3的堿基序列如SEQ?ID?NO：5所示，R3的堿基序列如SEQ?ID?NO：6所示；特異擴(kuò)增兩種突變位點(diǎn)c.383T>C和c.392G>T所在序列的上游引物F4和下游引物R4，其中，F(xiàn)4的堿基序列如SEQ?ID?NO：7所示，R4的堿基序列如SEQ?ID?NO：8所示；特異擴(kuò)增五種突變位點(diǎn)c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T和c.592C>T所在序列的上游引物F5和下游引物R5，其中，F(xiàn)5的堿基序列如SEQ?ID?NO：9所示，R5的堿基序列如SEQ?ID?NO：10所示；以及用于檢測上述十六種突變位點(diǎn)的熒光探針。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變熒光PCR熔解曲線檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括: 特異擴(kuò)增五種突變位點(diǎn) c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T 和 c.1388G>A 所在序列的上游引物Fl和下游引物R1，其中，F(xiàn)l的堿基序列如SEQ ID NO:1所示，Rl的堿基序列如SEQ ID NO:2所示； 特異擴(kuò)增三種突變位點(diǎn)c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T所在序列的上游引物F2和下游引物R2，其中，F(xiàn)2的堿基序列如SEQ ID NO:3所示，R2的堿基序列如SEQ ID NO:4所示； 特異擴(kuò)增突變位點(diǎn)c.95A>G所在序列的上游引物F3和下游引物R3其中，F(xiàn)3的堿基序列如SEQ ID NO:5所示，R3的堿基序列如SEQ ID NO:6所示； 特異擴(kuò)增兩種突變位點(diǎn)c. 383T>C和c.392G>T所在序列的上游引物F4和下游引物R4，其中，F(xiàn)4的喊基序列如SEQ ID NO:7所不，R4的喊基序列如SEQ ID NO:8所不； 特異擴(kuò)增五種突變位點(diǎn) c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T 和 c.592C>T 所在序列的上游引物F5和下游引物R5，其中，F(xiàn)5的堿基序列如SEQ ID NO:9所示，R5的堿基序列如 SEQ ID NO:10 所示； 以及用于檢測上述十六種突變位點(diǎn)的熒光探針。2.按權(quán)利要求1所述的一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變熒光PCR熔解曲線檢測試劑盒，其特征在于:所述熒光探針包括: 用于檢測突變位點(diǎn)c.13600T的熒光探針Pl，其堿基序列如SEQ ID NO: 11所示； 用于檢測突變位點(diǎn)c.871G>A的熒光探針P2，其堿基序列如SEQ ID NO:12所示； 用于檢測突變位點(diǎn)c.1004C>A和c.10240T的熒光探針P3，其堿基序列如SEQ ID NO:13所示； 用于檢測突變位點(diǎn)c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A和c.1387C>A的熒光探針P4，其喊基序列如SEQ ID NO: 14所不； 用于檢測突變位點(diǎn)c.95A>G的熒光探針P5，其堿基序列如SEQ ID NO:15所示； 用于檢測突變位點(diǎn)c.383T>C和c.392G>T的熒光探針P6，其堿基序列如SEQ ID NO:16所示； 用于檢測突變位點(diǎn)c.487G>A和c.493A>G的熒光探...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李慶閣，黃秋英，夏眾敏，楊蓉，
申請(專利權(quán))人：廈門大學(xué)，廈門致善生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：