本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種利用高通量組織芯片檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，包括：（1）使用Trizol試劑將腦組織進(jìn)行總RNA的分離；（2）對(duì)步驟（1）得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA；（3）將上述cDNA與SYBR熒光染料混合并進(jìn)行擴(kuò)增；（4）IBSP的表達(dá)通過抗GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用方程進(jìn)行比較閾值循環(huán)法；（5）構(gòu)建組織芯片，然后進(jìn)行免疫組化染色，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。本發(fā)明專利技術(shù)的方法使得檢測(cè)BSP的表達(dá)的靈敏性大大提高，能保證在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息；檢測(cè)BSP的表達(dá)具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)領(lǐng)域，特別涉及一種利用高通量組織芯片檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法。
技術(shù)介紹
膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中最多見的腫瘤，其中70%是惡性膠質(zhì)瘤，是CNS起源的腫瘤中最常見和最致命的腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率和死亡率。膠質(zhì)瘤中最有生物學(xué)侵襲性的亞型是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM，WHO IV級(jí)的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤)，其預(yù)后令人沮喪。目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括最大程度的切除腫瘤以及隨后使用DNA烷化劑、替莫唑胺進(jìn)行化療和放療。但盡管經(jīng)過上述的有效治療，GBM和間變型星形細(xì)胞瘤(WHO III級(jí))的預(yù)后生存期仍很短，中位生存期分別只有約14-16個(gè)月和2-5年。目前已做了大量的 努力來鑒定GBM中的基因?qū)W變化或其分子靶標(biāo)，這些基因變化或分子靶標(biāo)有助于區(qū)分GBM患者的不同亞組，每個(gè)亞組有不同的預(yù)后和對(duì)特異性治療不同的臨床反應(yīng)。替莫唑胺臨床反應(yīng)最主要的決定因素之一是MGMT的甲基化水平。MGMT啟動(dòng)子甲基化可見于40%-60%的病人，并與對(duì)替莫唑胺治療的良好反應(yīng)相關(guān)。最近，在多達(dá)75%的2級(jí)和3級(jí)彌漫性星形細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)了基因編碼的異檸檬酸脫氫酶(IDHl)的突變，目前已發(fā)現(xiàn)IDHl的突變是2-4級(jí)膠質(zhì)瘤總體生存期和無進(jìn)展生存期的一個(gè)主要的預(yù)后指標(biāo)。腫瘤的侵襲能力通常可通過癌細(xì)胞的高運(yùn)動(dòng)性和用于降低胞外基質(zhì)的蛋白酶的表達(dá)量增加來預(yù)測(cè)。骨唾液蛋白(BSP)作為基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2)的一個(gè)特異性的調(diào)控者，由IBSP基因編碼，屬于小型N端連接整合糖蛋白(SIBLING)基因家族一員。BSP在諸如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種癌癥中都是高表達(dá)的，并可能有助于這些癌的侵襲潛能。一項(xiàng)早期的研究表明BSP對(duì)于臨床局限的前列腺惡性腺癌在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著的預(yù)后價(jià)值。類似的結(jié)果在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、人類上皮癌、胰腺癌和骨肉瘤中都有發(fā)現(xiàn)。但在膠質(zhì)瘤組織中尚未有BSP的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值的研究。組織芯片(TMA)技術(shù)的發(fā)展，得益于生物芯片技術(shù)等的延伸。TMA具有高通量、快速、低誤差、用途廣泛等特點(diǎn)，目前主要應(yīng)用在腫瘤病理學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、藥物研究等。利用組織芯片技術(shù)可以在細(xì)胞水平定位和蛋白水平檢測(cè)相應(yīng)靶標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物與組織形態(tài)學(xué)研究以及臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合，同時(shí)還可以與原位雜交技術(shù)等相結(jié)合，因此TMA被廣泛應(yīng)用在腫瘤病理研究中，例如EMSY通路在乳癌及卵巢癌中的關(guān)系，AlphaB-Crystallin與乳癌的關(guān)系，TMPRSS2和ETS轉(zhuǎn)移因子在前列腺癌的重要作用等。TMA常見類型有演化TMA、預(yù)后TMA等。演化TMA指將某一腫瘤疾病發(fā)展的各個(gè)階段的標(biāo)本(諸如原發(fā)間變和繼發(fā)膠母、原發(fā)膠母和復(fù)發(fā)膠母等)集中在一塊TMA中，能在一張切片上同時(shí)看到腫瘤組織在原位、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等不同進(jìn)展階段的變化情況，可用以檢測(cè)特定腫瘤在不同發(fā)展階段的分子病理改變，有助于對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等過程的研究。預(yù)后TMA是將帶有可利用的臨床隨訪數(shù)據(jù)的腫瘤標(biāo)本集中在一張TMA中。使用預(yù)后TMA可以研究已知的分子靶標(biāo)的改變或信號(hào)傳導(dǎo)通路的變化對(duì)腫瘤患者預(yù)后的影響[2]。TMA陣列中每個(gè)組織片段都對(duì)應(yīng)于相應(yīng)患者，因此利用TMA，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)和隨訪資料，可以對(duì)腫瘤患者進(jìn)行大規(guī)模的回顧性數(shù)據(jù)分析，為疾病的早期診斷、早期治療等提供指導(dǎo)。文獻(xiàn)報(bào)道利用預(yù)后TMA發(fā)現(xiàn)Cyclooxygenase-2對(duì)鼻咽癌患者放療預(yù)后有預(yù)測(cè)價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用高通量組織芯片檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，該方法使得檢測(cè)BSP的表達(dá)的靈敏性大大提高，能保證在極少的標(biāo)本中獲得足夠的信息。本專利技術(shù)的一種利用高通量組織芯片檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，包括:(I)使用Trizol試劑將腦組織進(jìn)行總RNA的分離；(2)對(duì)步驟(I)得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；(3)將上述cDNA與SYBR熒光染料混合并進(jìn)行擴(kuò)增；(4)IBSP的表達(dá)通過抗GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用以下方程進(jìn)行比較閾值循環(huán)法:表 =2~^Δ目標(biāo)基因的ct值—Δ參照ct值).(5)構(gòu)建組織芯片，然后進(jìn)行免疫組化染色，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。步驟(I)中所述的腦組織為膠質(zhì)瘤或正常腦組織。步驟(2)中所述的總RNA的質(zhì)量為2ug,得到cDNA的質(zhì)量為20ng。步驟(2)中所述的反轉(zhuǎn)錄為使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄箱進(jìn)行的。步驟(3)中所述的擴(kuò)增為在CFX96實(shí)時(shí)探測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行。步驟(3)中所述的擴(kuò)增條件為42°C孵育60分鐘，95°C孵育5分鐘后冰上冷卻。所用的引物為:IBSP，5’-AAAGTGAGAACGGGGAACCTR-3’正鏈，5’-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3’ 反鏈；GAPDH, 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ 正鏈，5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ 反鏈。在本專利技術(shù)中我們?cè)噲D通過實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)和組織芯片的免疫組化來檢測(cè)BSP的表達(dá)，以研究BSP的表達(dá)和膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征間的關(guān)系。我們的研究顯示BSP在特定的膠質(zhì)瘤組織中是高表達(dá)的，并且其高表達(dá)與腫瘤級(jí)別相關(guān)，預(yù)示了膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后不良。本專利技術(shù)利用高通量組織芯片進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤預(yù)后方面的研究，制備的組織芯片屬于預(yù)后TMA。進(jìn)行的TMA制備總共包含300例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和16例正常腦組織標(biāo)本。300例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，星形細(xì)胞起源占78.1%，其他包括少突、室管膜、原始神經(jīng)外胚層等起源占21.9% ;病理級(jí)別中，高級(jí)別膠質(zhì)瘤占60.1%，GBM占39.5%。制備的腦膠質(zhì)瘤組織芯片目前在國(guó)內(nèi)樣本量最大，隨訪周期較長(zhǎng)，94%左右(284/300)的患者獲得了詳細(xì)的隨訪。腦膠質(zhì)瘤組織芯片的制備為潛在性的腦膠質(zhì)瘤靶標(biāo)G0LPH3、BSP與膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)性研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。BSP通過何種分子機(jī)制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展已在多項(xiàng)研究中有闡述。BSP可以與MMP2結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性，從而激活MMP通路。 它還可加快增殖、侵襲以及癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。BSP也可以作為一個(gè)前血管生成因子通過與整合蛋白ανβ3結(jié)合促進(jìn)血管生成。然而，BSP在膠質(zhì)瘤發(fā)生和進(jìn)展中的作用尚未知。膠質(zhì)瘤患者血清中BSP的含量及其與預(yù)后和治療反應(yīng)的關(guān)系仍有待研究。血清BSP含量已被證明可用于預(yù)測(cè)乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移和生存以及前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移。研究血清BSP是否能作為一個(gè)便利的分子標(biāo)記物來定義有腫瘤進(jìn)展或預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的膠質(zhì)瘤病人亞組是很有臨床意義的。2級(jí)或3級(jí)的膠質(zhì)瘤病人在復(fù)發(fā)時(shí)有可能向4級(jí)GBM進(jìn)展(繼發(fā)性GBM)。同樣也有可能部分原發(fā)的GBM是在經(jīng)過了一系列類似繼發(fā)GBM的遺傳學(xué)改變后才發(fā)生的，但在腫瘤發(fā)生前并沒有引起臨床的重視，直到其惡性進(jìn)展為GBM發(fā)生才發(fā)現(xiàn)。目前為止還沒有一個(gè)很好的方法能區(qū)分原發(fā)和繼發(fā)的GBM，因?yàn)槎叩慕M織病理改變還無法區(qū)分。我們使用實(shí)時(shí)RT-PCR和組織芯片的免疫組化方法檢測(cè)了包含15例正常腦組織及270例膠質(zhì)瘤樣本中BSP的表達(dá)量。通過Kaplan-Meier方法計(jì)算累積生存并使用log-rank測(cè)試來分析。應(yīng)用階梯式前行Cox回歸模型進(jìn)行單因素及多因素分析。高級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本中BSP無論在m本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種利用高通量組織芯片檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，包括：（1）使用Trizol試劑將腦組織進(jìn)行總RNA的分離；（2）對(duì)步驟（1）得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；（3）將上述cDNA與SYBR熒光染料混合并進(jìn)行擴(kuò)增；（4）IBSP的表達(dá)通過抗GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用以下方程進(jìn)行比較閾值循環(huán)法：表達(dá)折疊差異=2?(Δ目標(biāo)基因的ct值–Δ參照ct值)；（5）構(gòu)建組織芯片，然后進(jìn)行免疫組化染色，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。
【技術(shù)特征摘要】
1.種利用高通量組織芯片檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，包括: (1)使用Trizol試劑將腦組織進(jìn)行總RNA的分離； (2)對(duì)步驟(1)得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA； (3)將上述cDNA與SYBR熒光染料混合并進(jìn)行擴(kuò)增； (4)IBSP的表達(dá)通過抗GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用以下方程進(jìn)行比較閾值循環(huán)法:表達(dá)折 =2 目標(biāo)基因的ct值-Δ參照ct值).(5)構(gòu)建組織芯片，然后進(jìn)行免疫組化染色，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。2.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(1)中所述 的腦組織為膠質(zhì)瘤或正常腦組織。3.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高通量組織芯片檢測(cè)BSP在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的總RNA的質(zhì)量為2ug，得到cDNA的質(zhì)量為20ng。4.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳菊祥，徐濤，秦榮，盧亦成，嚴(yán)勇，周勁旭，王洪祥，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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