高通量測序檢測人循環腫瘤DNA EGFR基因的捕獲探針及試劑盒制造技術

本發明專利技術涉及基于高通量測序檢測人循環腫瘤DNA?EGFR基因的捕獲探針及試劑盒。本發明專利技術的人循環腫瘤DNA?EGFR基因捕獲探針是多種探針的混合物，所述多種探針分別能夠捕獲人EGFR基因上不同的目標區域。在優選的實施方案中，所述多種探針的集合能夠捕獲人循環腫瘤DNA?EGFR基因全部編碼外顯子區域及外顯子內含子交界區域。

【技術實現步驟摘要】
專利
本專利技術涉及基因檢測領域，具體涉及一種基于高通量測序檢測人循環腫瘤DNAEGFR基因的捕獲的探針及試劑盒。
技術介紹
在血液中存在著游離的小片段DNA(cell-freeDNA，cfDNA)，它們來自死亡的細胞。通常死亡的細胞會被清除掉，因此cfDNA的含量是非常低的，通常一個健康人的1ml血漿中含25ngcfDNA。而癌癥患者的cfDNA的含量高出正常幾倍，其中一部分是ctDNA(circulatingtumorDNA)。ctDNA的相對含量與腫瘤的負荷和對治療的反應是相關的，可用于鑒定驅動基因、指導臨床治療、監測臨床治療效果及癌癥復發、揭示治療抗性以及檢測疾病進展。在有些方面ctDNA方法的靈敏度甚至高傳統的手段。例如，與傳統的影像學檢測相比，追蹤早期乳腺癌患者術后血液中的腫瘤DNA，可以提前7.9個月發現乳腺癌復發。在肺癌中檢測cfDNA的EGFR突變對肺癌也有著重要的診斷價值。ctDNA在癌癥早期就可以被檢測到。因為cfDNA容易收集，在肺癌中已顯示與組織中的變異高度一致，因此ctDNA的液體活檢越來越受到關注。血液中ctDNA含量，在癌癥早期占cfDNA的比例是非常低，通常小于0.1％。ctDNA檢測方法很多，如用數字化PCR(DigitalPCR)，或下一代測序(NextGenerationSequencing,NGS)等。通過NGS優化ctDNA的深度測序(CAPP-seq)使突變檢測的敏感度達到0.02％，特異性為100％。此方法結合降低背景噪聲的iDES(integratedDigitalErrorSuppression)分析方法后，使檢測頻率的閾值進一步下降到0.004％。從而大大提高了分析CtDNA的檢出率。肺癌(lungcancer)是全球范圍內最普遍和最致命的惡性腫瘤，5年生存率僅為17％左右，每年造成160萬人的死亡。在中國吸煙和環境污染是兩個最主要的肺癌致病因素。據統計2015年在中國有60萬肺癌患者死亡，新增73萬例。并有增長趨勢，到2025年可能造成100萬人死亡。肺癌根據組織病理學分類分為小細胞肺癌(small-celllungcarcinomas,SCLC)與非小細胞肺癌(no-small-celllungcarcinomas,NSCLC)，非小細胞肺癌又分為肺腺癌(adenocarcinomas)、鱗狀細胞癌(squamouscellcarcinomas)和大細胞肺癌(large-cellcarcinomas)。比例最大的是肺腺癌，占40％，其次為占30％的鱗狀細胞癌，大細胞肺癌和小細胞肺癌各占15％。全身性化療一直是肺癌的主要治療方式，缺乏特異性，副作用大。隨著在NSCLC中一些重要基因變異的發現，針對這些基因變異的靶向藥物被研制出來并已用于臨床治療。如吉非替尼是針對EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)變異的NSCLC靶向治療藥物。EGFR在細胞信號轉導中起著重要作用，一旦被激活，可導致腫瘤細胞內酪氨酸蛋白激酶活化和自身的磷酸化，從而使細胞增生、轉移、血管生成和細胞凋亡的抑制。EGFRexon19缺失和L858R突變激活EGFR，使對EGFR的抑制劑藥物更敏感。在亞洲人中約50％NSCLC中含有EGFR，并且90％是上述激活型的突變。因此EGFR突變的鑒定對治療NSCLC有著非常重要的作用。通過對人循環腫瘤DNAEGFR基因的檢測可篩檢出肺癌及其他相關惡性腫瘤的高危人群，利于該類疾病的早期診斷治療。耗資30億美元歷時10余年完成的人類基因組計劃(HumanGenomeProject,HGP)給基因組學研究帶來了天翻地覆的變化，通過測定人類基因組DNA的序列，探尋基因在染色體上的位置，明確基因的結構和功能，解讀人類的全部遺傳信息，人類第一次在分子水平上全面認識自我。在這期間，建立了兩項非常重要的高通量技術：基因芯片和第二代測序技術。這兩種技術進一步結合，就產生了一種新的解決方案：目標序列捕獲測序技術。目標序列捕獲是指通過某種方法有選擇性的分離或者富集基因組的特定區域。一種重要的方法是根據核酸分子堿基互補雜交原理設計與目的區域互補的探針序列，而根據雜交時狀態不同，目標序列捕獲可以分為固相雜交法和液相雜交法。液相雜交是通過在溶液中，目標DNA片段和已帶有生物素標記探針直接雜交，然后通過生物素親和素反應使目標DNA片段錨定在帶有親和素的微珠上。洗去非目標DNA，洗脫后，富集的DNA用于測序。相較于固相雜交，液相雜交具有操作簡便、易于自動化等優點。常規的探針設計方式為探針間首尾相連，且不存在重疊部分，這樣做的缺點是在基因文庫中EGFR基因多數片段只能被單一探針捕獲，且探針交界處的捕獲效果差，造成捕獲效率偏低。同時，常規探針設計方式對探針長度和Tm值無特殊要求，這就導致探針間差異較大，在相同的實驗條件下絕大多數探針不能同時達到最佳的捕獲效果。本專利技術基于CAPP-seq和數字信號技術，設計EGFR探針檢測血液cfDNA中EGFR的變異。當測序深度達到10000×時，有效深度可達5000×，檢測突變的敏感性達到0.02％。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種基于高通量測序檢測人循環腫瘤DNAEGFR基因的捕獲探針及試劑盒。本專利技術的人循環腫瘤DNAEGFR捕獲探針是多條探針的混合物，所述多條探針分別能夠捕獲人EGFR基因上不同的目標區域。在優選的實施方案中，所述多條探針的集合能夠捕獲人循環腫瘤DNAEGFR基因全部編碼外顯子區域及外顯子內含子交界區域，減少非特異性捕獲，同時雜交溫度相近。根據本專利技術的一個方面，提供用于人循環腫瘤DNAEGFR基因變異的高通量測序檢測的捕獲探針，所述捕獲探針為多條探針的混合物；所述多條探針能覆蓋全部目標區域；所述多條探針之間存在重疊區，使得所有目標區域均被兩條以上探針覆蓋；所述多條探針的長度均為90-130bp；所述多條探針的Tm值在65-75℃之間。本專利技術中，目標區域是指包含人EGFR基因上的任何一個或多個變異的區域。本專利技術中，全部目標區域優選為人EGFR基因全部編碼外顯子區域及外顯子內含子交界區域。根據本專利技術的一個方面，提供用于人人循環腫瘤DNAEGFR基因變異的高通量測序檢測的捕獲探針混合物，所述捕獲探針混合物至少包括具有SEQIDNO:1-132所示序列的132條探針。在一些實施方案中，所述捕獲探針混合物由具有SEQIDNO:1-132所示序列的132條探針組成。在另一些實施方案中，所述捕獲探針混合物還進一步包括一條或更多條具有選自SEQIDNO:133-195的序列的探針。在預選的實施方案中，所述捕獲探針混合物為SEQIDNO:1-195所示的195條探針的混合物。在一些優選的實施方案中，捕獲探針混合物中包含的探針按相同比例混合在一起。優選地，本專利技術的捕獲探針混合物中每條探針均具有標記，優選為生物素標記。本專利技術的捕獲探針混合物的工作濃度是0.1PM～6PM，優選1.5PM；其中PM＝皮摩爾/升。根據本專利技術的另一個方面，提供人循環腫瘤DNAEGFR基因變異檢測試劑盒，其中包含上述探針混合物。本專利技術的人循環腫瘤DNAEGFR基因變異檢測試劑盒還可以包含用于人EGFR基因變異的高通量測序檢測的任何本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于人循環腫瘤DNA?EGFR基因變異的高通量測序檢測的捕獲探針，所述捕獲探針為多條探針的混合物；所述多條探針能覆蓋全部目標區域；所述多條探針之間存在重疊區，使得所有目標區域均被兩條以上探針覆蓋；所述多條探針的長度均為90?130bp；所述多條探針的Tm值在65?75℃之間。

【技術特征摘要】
1.用于人循環腫瘤DNAEGFR基因變異的高通量測序檢測的捕獲探針，所述捕獲探針為多條探針的混合物；所述多條探針能覆蓋全部目標區域；所述多條探針之間存在重疊區，使得所有目標區域均被兩條以上探針覆蓋；所述多條探針的長度均為90-130bp；所述多條探針的Tm值在65-75℃之間。2.權利要求1的捕獲探針，所述捕獲探針至少包括具有SEQIDNO:1-132所示序列的132條探針。3.權利要求2的捕獲探針，所述捕獲探針由具有SEQIDNO:1-132所示序列的132條探針組成。4.權利要求2的捕獲探針，所述捕獲探針還包括一條或更多條具有選自SEQIDNO:133-195的序列的探針。5.權利要求4的捕獲探針，所述捕獲探針為SEQIDNO:1-195所示的195條探針的混合物：6.權利要求2-5任一項的捕獲探針，其中混合物中包含的探針按相同比例混合在一起。7.權利要求1-6任一項的捕獲探針，其中每條探針均具有生物素標...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李福根，熊磊，金其煌，覃灝，
申請(專利權)人：埃提斯生物技術上海有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31