本發(fā)明專利技術(shù)揭示了一種組織相容性抗原決定簇基因高通量測序的HLA基因分型方法，基于各種高通量測序平臺數(shù)據(jù)的圖形化HLA分型軟件，在臨床或生物醫(yī)學上均具有重要的意義。相比傳統(tǒng)的PCR-SBT方法測序方法，高通量測序技術(shù)無論在經(jīng)濟成本還是時間成本上，均具有顯著的優(yōu)勢。高通量測序技術(shù)只需通過一次實驗就能夠讀取數(shù)千份樣本的HLA序列數(shù)據(jù)，并一次性達到HLA分型的高分辨率，同時還可發(fā)現(xiàn)新的等位基因。在檢測通量、數(shù)據(jù)質(zhì)量、成本控制等方面都有質(zhì)的飛躍，真正做到了“低分價格，高分數(shù)據(jù)”，能避免多次配型給患者造成的額外經(jīng)濟負擔，同時快捷的分型方法，也能減少查找與患者HLA匹配的供者的周期，為治療爭取了寶貴的時間。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種基因測序及分型方法，尤其涉及一種組織相容性抗原決定簇基因的高通量測序及HLA基因分型方法。
技術(shù)介紹
HLA所在位點超過200個基因，在人類免疫系統(tǒng)中有著關(guān)鍵的作用。HLA具有高度的多態(tài)性，包括約7000個已知的等位基因(http://www.eb1.ac.uk/imgt/hla/)。在骨髓和其它器官移植中，供者和受者之間HLA基因型的匹配程度越高，排斥反應(yīng)的發(fā)生率就越低，移植成功率和移植器官長期存活率就越高。反之，就越容易發(fā)生排斥反應(yīng)。Stephanie J.Lee等人在2007年的一項大規(guī)模研究中，分析了美國國家骨髓庫(National Marrow DonorsProgram)記錄的自1988年到2003年的3857起移植數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)8個HLA相關(guān)等位基因完全匹配的患者存活率最高。這8個等位基因分別為HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1、-DQA1、-DPBI和-DPA1，其中HLA-A、-B、-C或-DRBl中任意一個的不匹配，都會帶來較高的致死率:1年內(nèi)的存活率從8個完全匹配時的52%降到43%。而兩個或更多位點的不匹配，會顯著加劇這種風險(Lee, Klein et al.2007)。與此同時，移植的時間，同樣對患者移植后的效果很重要。Stephanie J.Lee等人還發(fā)現(xiàn),只有6個HLA基因位點匹配的病人,如果在患病的早期進行移植，其效果仍然比8個基因完全匹配但卻是在疾病發(fā)展到高級階段時移植的好。這是因為，在移植時疾病的狀態(tài)，是唯一能夠被醫(yī)生掌握的因素，盡早的移植恐怕是能夠影響患者存活率的最重要步驟(Lee，Klein et al.2007)。因此，準確而又快速的HLA分型技術(shù)，對需要進行骨髓或器官移植的病人而言，就顯得尤為關(guān)鍵。HLA基因型除了在臨床上被大量地用于器官移植中的供體和受體配型外，也與許多特定的疾病如自身免疫疾病、傳染疾病以及一些癌癥等存在密切的關(guān)聯(lián)。例如，HLA_DRB1*04:01 被證實與風濕性關(guān)節(jié)炎(Angelini, Morozzi et al.1992)、I 型糖尿病(Windsor, Puschendorf et al.2005),多發(fā)性硬化癥(Laroni, Calabrese et al.2006)等密切相關(guān)。而HLA-B*57:01則能夠保護人類不易受HIV的感染(Fellay，Shianna et al.2007)。此外，盡管存在許多基因影響乳腺癌的易感性，而且這些基因都與HLA不相關(guān)，但在白種人中，仍然發(fā)現(xiàn)HLA II型基因HLA-DQB*03032和HLA_DRB1*11可能對人類乳腺癌具有保護性的作用(Chaudhuri, Cariappa et al.2000)。因此,HLA分型技術(shù)還能夠用來預(yù)測人類對某些特定疾病的抗性或易感性。藥物不良反應(yīng)(ADR)是指患者在使用正常劑量的某種藥物用于預(yù)防、診斷、治療疾病或調(diào)節(jié)生理機能時出現(xiàn)的有害的和與用藥目的無關(guān)的作用。其中許多都屬于T細胞對藥物免疫反應(yīng)所引起的藥物過敏綜合征，而且其中一些如Stevens-Johnson綜合征(Stevens-Johnson’ s syndrome, SJS)和中 毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermalnecrolysis, TEN)甚至會帶來嚴重的后果。研究發(fā)現(xiàn)，許多T細胞調(diào)控的藥物不良反應(yīng)與特定的HLA等位基因型有關(guān)，例如，Allopurinol (—種用于治療痛風和高尿酸血癥的藥物)與某些漢族人中攜帶的HLA-B*58:02基因，Carbamazepine (一種治療癲癇癥的抗痙攣藥)與某些漢族、印度和泰國人中攜帶HLA-B*15:02基因(Thorsby 2011; Bharadwaj, Illinget al.2012)。攜帶某些特定HLA基因標記的病人對某種藥物發(fā)生ADR的風險，相比正常人，能高出500-1000倍，而這遠遠高出了已知的HLA與疾病之間的關(guān)系(Thorsby 2011)。在個性化醫(yī)療即將到來的時代，基于高通量高分辨率的HLA分型技術(shù)，預(yù)先檢測特定的HLA等位基因能夠幫助臨床醫(yī)生判斷患者服用一些藥物所發(fā)生不良反應(yīng)的風險。總之，研究HLA分型的高通量方法，不僅在臨床上具有十分重要的意義，而且在疾病的預(yù)防和控制方面，也能發(fā)揮積極的效果。所以組織相容性抗原決定簇基因高通量測序檢測技術(shù)一是可以應(yīng)用在與手術(shù)移植有關(guān)(如器官骨髓移植等)的臨床上；二是與個性化醫(yī)療中有關(guān)的疾病預(yù)防與控制或藥物不良反應(yīng)評估上；三則是器官(或骨髓)捐獻和移植庫對眾多捐獻者的常規(guī)HLA分型檢測等等。HLA分型技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了兩個階段:血清學分型階段和DNA分型階段。近來，隨著PCR技術(shù)的成熟，血清學分型已基本被放棄，HLA分型全面進入DNA分型階段。與血清學相比較，DNA分型分辨率高，錯誤率少(Dunn 2011)。目前已經(jīng)建立起來的HLA分型技術(shù)包括以下三種:PCR-SSP (PCR with sequence-specific primers,序列特異引物PCR), PCR-SSOP (PCR with sequence-specific oligonucleotide probes, PCR 寡核苷酸探針)和 PCR-SBT (PCR with genomic DNA sequencing-based typing, PCR 產(chǎn)物直接測序分型)(Lind, Ferriola et al.2010; Dunn 2011)。由于HLA等位基因數(shù)目的不斷增加，PCR-SSP和PCR-SSOP方法越來越難以適應(yīng)新的標準，許多實驗室已經(jīng)停止使用這些技術(shù)，PCR-SBT方法逐漸成為人們可接受的標準方法(Dunn 2011)。理論上，由于采用了Sanger測序，PCR-SBT是最直觀、最準確的方法，同時也是唯一用來定義新的等位基因的方法(Gabriel, Danzer et al.2009; Lind, Ferriola et al.2010),因此對每一個 HLA分型實驗室而言，該方法顯得至關(guān)重要。PCR-SBT是一種簡單快速的序列分型方法，首先利用PCR擴增獲得DNA片段，再基于Sanger測序得到擴增片段的DNA序列。據(jù)此建立的HLA基因分型技術(shù)不但能得到高分辨率結(jié)果，還可顯示HLA基因間高度可變區(qū)的全部核苷酸序列，但有時也會產(chǎn)生模棱兩可的結(jié)果(Gabriel, Danzer et al.2009; Lind, Ferriolaet al.2010; Dunn 2011)。其主要原因有:(I)測序區(qū)域內(nèi)(通常，對HLA I型基因而言為外顯子2和3，II型為外顯子2)的等位基因序列相同，而等位基因多態(tài)性位點位于分析區(qū)以外；(2)在Sanger測序反應(yīng)中，核苷酸同時摻入到所有的DNA模板中，2個等位基因被一起擴增測序，導(dǎo)致PCR-SBT分型技術(shù)測出順/反模棱兩可的結(jié)果，有時不同等位基因間的組合可得到相同的雜合子序列，無法得到確定唯一的HLA基因型，如A*01:01:01:01+ 02:01:01:01 = A*01:14 + 92:21 = A*36:04 + 02:36 (Adams, Barracchini et al.2004;本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
組織相容性抗原決定簇基因高通量測序的HLA基因分型方法，針對已知并已被收錄的HLA等位基因型，其特征在于包括步驟：Ⅰ、采用高通量測序平臺擴增測序得到reads序列片段；Ⅱ、以最新的IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫中包含的HLA等位基因為參考序列，將步驟Ⅰ測序得到的reads序列片段與參考序列采用核酸序列比對工具進行比對，得到比對結(jié)果；Ⅲ、對比對結(jié)果進行錯配、最佳匹配、長度和/或尾端匹配的多重篩選、過濾優(yōu)化；Ⅳ、定義central?reads、所有reads的最小測序覆蓋深度MCOR、central?reads的最小測序覆蓋深度MCCR，計算經(jīng)步驟Ⅲ過濾后每條參考序列的MCOR和MCCR值，并舍棄MCOR小于20且MCCR小于10的參考序列，對余下的參考序列，列出同一HLA基因座位所有的可能組合，包括單一序列的純合子及兩兩組合的雜合子，計算每種組合的不同reads的數(shù)目，reads數(shù)目最多的組合判定為相應(yīng)的HLA等位基因型，其中central?reads指的是在某個給定位點，參與比對的reads在給定位點左邊的序列長度與右邊的長度之比在0.5~2之間。
【技術(shù)特征摘要】
1.組織相容性抗原決定簇基因高通量測序的HLA基因分型方法，針對已知并已被收錄的HLA等位基因型，其特征在于包括步驟: I.采用高通量測序平臺擴增測序得到reads序列片段； I1、以最新的IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫中包含的HLA等位基因為參考序列，將步驟I測序得到的reads序列片段與參考序列采用核酸序列比對工具進行比對，得到比對結(jié)果； II1、對比對結(jié)果進行錯配、最佳匹配、長度和/或尾端匹配的多重篩選、過濾優(yōu)化； IV、定義centralreads、所有reads的最小測序覆蓋深度MCOR、central reads的最小測序覆蓋深度MCCR，計算經(jīng)步驟III過濾后每條參考序列的MCOR和MCCR值，并舍棄MCOR小于20且MCCR小于10的參考序列，對余下的參考序列，列出同一 HLA基因座位所有的可能組合，包括單一序列的純合子及兩兩組合的雜合子，計算每種組合的不同reads的數(shù)目，reads數(shù)目最多的組合判定為相應(yīng)的HLA等位基因型,其中central reads指的是在某個給定位點，參與比對的reads在給定位點左邊的序列長度與右邊的長度之比在0.5^2之間。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織相容性抗原決定簇基因高通量測序的HLA基因分型方法，其特征在于:所述高通量測序平臺至少包括Roche 454, Illumina Solexa, LifeTechnologies 1n torrent PGM。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織相容性抗原決定簇基因高通量測序的HLA基因分型方法，其特征在于:所述核酸序列比對工具至少為BLASTN。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織相容性抗原決定簇基因高通量測序的HLA基因分型方法，其特征在于:步驟III中所述錯配篩選是指去除比對中含有錯配或者...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王申俊，其他發(fā)明人請求不公開姓名，
申請(專利權(quán))人：蘇州晶因生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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