一種雜草稻檢測用引物及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種雜草稻檢測用引物及應用該引物的分子檢測試劑盒與檢測方法。該檢測用引物包括正向引物5’-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’和反向引物5’-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3’。檢測方法通過DNA提取后，利用上述引物進行PCR擴增后，電泳分離，染色觀察。利用本發明專利技術檢測方法能夠有效檢測雜草稻和栽培稻，以及雜草稻與栽培稻發生田間雜交稻。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種雜草稻快速檢測用引物。
技術介紹
雜草稻(weedy rice)往往與栽培稻相伴生，分布極為廣泛，幾乎存在于世界上所有的稻作生產區。在世界上溫帶地區一些種植水稻國家危害已成為僅次于稗草和千金子的第三大雜草，密度達到2-40株/m2時可使水稻減產19%-89%，全季度干擾可使水稻減產61%，且蔓延速度不斷加快，危害程度不斷升級。雜草稻之所以會對水稻的生產造成較大的危害，主要是由于:I)其與栽培稻的相似性，使它和栽培水稻對對除草劑的反應一致，世界上尚無有效的除草劑；2)雜草特性強，主要表現為種子落粒性、休眠性及抗逆性，從而使雜草稻能夠忍受惡劣的環境條件，種子逃脫收獲，進入土壤種子庫，并度過惡劣條件時期，在適宜條件下萌發再生，從而使雜草稻在田間人工種植的環境下不斷繁衍，特別是由于水稻輕型栽培技術的推廣應用以及直播面積的擴大，更適合其發生，種群迅速擴大；3)競爭能力強，在水稻整個生長期間，雜草稻與栽培稻競爭光和礦質營養等；4)種子污染,雜草稻穎殼色多樣，種皮色多樣，種子混在收獲的水稻種子中，導致栽培稻種子商業品質的降低。此外，我國轉不同外源基因的水稻正陸續培育出來，它們的即將釋放正吸引世人的關注。其中轉基因水稻的抗性基因向雜草稻逃逸的風險評價較早就受到關注，這是因為:I)空間上，雜草稻和轉基因水稻伴生；2)時間上，雜草稻將與轉基因水稻花期相遇，通過將全國采集來的雜草稻進行田間種植，發現我國各地雜草稻開花期與各地栽培水稻重疊相間；3)雜草稻與轉基因水稻在生物學上有相當高的雜交親和性，且雜種后代能正常繁殖。當前，由于雜草 稻與栽培稻的相似性，使它和栽培水稻對對除草劑的反應一致，世界上尚無有效的除草劑。世界其他國家的防除經驗表明，保證栽培稻用種不被雜草稻污染，是防止雜草稻快速蔓延擴散的重要措施。因此，快速準確鑒別我國雜草稻，將極大促進我國雜草稻的防除工作。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了解決現有技術中存在的缺陷，提供一種能夠快速檢測雜草稻的引物及應用該引物的分子檢測試劑盒與檢測方法。為了達到上述目的，本專利技術提供了一種雜草稻檢測用引物WR4，包括正向引物5，-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3 ’和反向引物 5 ’ -TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3，。本專利技術還提供了一種雜草稻快速分子檢測試劑盒，該試劑盒采用引物WR4，包括正向引物 5 ’ -TTACAGGGGAGCAGAAACA-3，，反向引物 5 ’ -TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3，。本專利技術還提供了一種雜草稻快速檢測方法，該檢測方法用于檢測區分雜草稻與栽培稻；包括以下步驟: (I)DNA提取:提取待檢測的雜草稻或栽培稻DNA ；(2)PCR擴增:將步驟(I)提取的DNA進行PCR擴增；PCR擴增采用WR4引物，包括正向弓丨物(WR4-F) 5’-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’，反向弓丨物(WR4-R)5’ -TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3’ ； (3)電泳:將步驟(2)中的PCR產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，染色觀察。其中，步驟(I)中DNA提取過程如下:取待檢測的雜草稻或栽培稻的穎果去殼，力口65°C預熱的提取液(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA, 500 mmol/L NaCl,1.5% SDS)研磨后，再加入65°C預熱的提取液沖洗，轉入離心管中，加入65°C預熱的提取液，65°C水浴30分鐘；加入NaAC，搖勻；加入氯仿-異丙醇-乙醇混合液，搖勻，離心后，移取上清液；向上清液中加入_20°C預冷的無水乙醇，搖勻，離心后，取沉淀，70%乙醇漂洗后，置于吸水紙上得干燥DNA ;所述氯仿-異丙醇-乙醇混合液中異丙醇的體積百分含量為4%，乙醇的體積百分含量為10-20%。或取待檢測的雜草稻或栽培稻的干標本或新鮮材料，在液氮中研磨成粉末，加入65°C預熱的提取液(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA, 500 mmol/L NaCl,1.5% SDS),搖勻，65°C水浴30分鐘；加入NaAC，搖勻；加入氯仿-異丙醇-乙醇混合液，搖勻，離心后，移取上清液；向上清液中加入-20 0C預冷的無水乙醇，搖勻，離心后，取沉淀，70%乙醇漂洗后，置于吸水紙上使DNA干燥；所述氯仿-異丙醇-乙醇混合液中異丙醇的體積百分含量為4%,乙醇的體積百分含量為10-20%。上述干燥后的DNA在進行步驟(2) PCR擴增前，先加入TE緩沖液溶解，然后加入RNA酶去除RNA。步驟(2)中PCR擴增程序為94°C預變性5 min，94°C變性45 s，55°C退火45 S，72°C延伸I min，30個循環；最后72°C延伸8 min。本專利技術相比現有技術具有以下優點:利用水稻RC基因進行6682全長測序，發現我國的雜草稻缺乏其中的14bp，進而在14bp兩側開發設計出本專利技術WR4引物。利用該引物進行PCR擴增，能有效檢測雜草稻和栽培稻，以及雜草稻與栽培稻發生田間雜交稻。附圖說明圖1為各樣品利用本專利技術雜草稻快速檢測方法的染色圖。圖中，M為IOObp Marker ;1為日本晴(水稻)；3為珍汕97B(水稻)；5為9311 (水稻)；2,4,6 9，11 17為雜草稻；10為雜草稻與栽培稻發生田間異交稻。具體實施例方式下面結合具體實施例對本專利技術雜草稻檢測用引物及檢測方法進行詳細說明。本專利技術雜草稻檢測用弓丨物包括包括正向引物5’-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’和反向引物 5’ -TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3’。利用上述引物進行雜草稻快速檢測的方法如下: 1、DNA提取:提取各樣品的DNA，其中，樣品1-4采用穎果，樣品5-10采用新鮮植株，樣品11-17采用雜草稻干標本。提取方法如下: (I)穎果 取水稻的單粒種子去殼后于研缽中；力口 300μL 預熱(65°C )抽提液(100 mmol L-1 Tris-HCl pH 8.0，20 mmol L-1EDTA, 500 mmol I71 NaCl,1.5% SDS)研磨后，再加入IOOy L預熱(65°C )抽提液沖洗，轉A1.5/mL離心管中，加預熱(65°C )400 u L抽提液溶液。65°C水浴30分鐘，期間混勻3次；加入100 u I NaAc (1/4體積)，搖勻； 加入400 ii I (等體積)氯仿-異戍醇(內含4% (v/v)異戍醇，10% (v/v)乙醇)(其中樣品3提取DNA時采用氯仿-異戊醇內含4% (v/v)異戊醇，20% (v/v)乙醇)，搖勻； 離心(12000rpm> 5min)，要注意配平;轉移上清液至另一 1.5ml管中，400ii I左右； 加入-20°C預冷的無水乙醇(2倍體積)至一定刻度,搖勻； 離心(12000rpm>5min); 棄無水乙醇，加入70%乙醇400ul左右，稍微混勻后放置IOmin左右，棄酒精、倒扣離心管于吸水紙上使DNA干燥； 加入200 u I TE，加入Iul RNA酶，用手輕彈使之溶解，室溫放置10分鐘，_20°C保本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種雜草稻檢測用引物，包括正向引物5’?TTACAGGGGAGCAGAAACA?3’和反向引物5’?TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC?3’。

【技術特征摘要】
1.一種雜草稻檢測用引物，包括正向引物5’ -TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’和反向引物·5’ -TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3’。2.一種雜草稻快速分子檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒采用正向引物·5’ -TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’，反向引物 5’ -TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3’。3.一種雜草稻快速檢測方法，所述檢測方法用于檢測區分雜草稻與栽培稻；其特征在于:包括以下步驟: (1)DNA提取:提取待檢測的雜草稻或栽培稻DNA; (2)PCR擴增:將步驟(I)提取的DNA進行PCR擴增；所述PCR擴增的正向引物為·5’ -TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’，反向引物為 5’ -TCTTCTCCTCTCTITCAGCAC-3’ ； (3)電泳:將步驟(2)中的PCR產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，染色觀察。4.根據權利要求3所述的雜草稻快速檢測方法，其特征在于:所述步驟(I)中DNA提取過程如下:取待檢測的雜草稻或栽培稻的穎果去殼，加65°C預熱的提取液研磨后，再加A 65°C預熱的提取液沖洗，轉入離心管中，加入65°C預熱的提取液，65°C水浴30分鐘；力口入NaAC，搖勻；加入氯仿-異丙醇-乙醇混合液，搖勻，離心后，移取上清液；向上清液中加入_20°C預冷的無水乙醇，搖勻，離心后，取沉淀，70%乙...

【專利技術屬性】
技術研發人員：戴偉民，李瀟艷，宋小玲，強勝，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：