本發明專利技術提供了一個長鏈非編碼RNA基因LINC00312的應用方法，根據該基因序列，設計并合成實時定量PCR引物和原位雜交探針，制備用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的制劑。利用該制劑，在鼻咽癌臨床病例標本中檢測LINC00312的表達水平，發現LINC00312在鼻咽癌中表達顯著下調，但有轉移的鼻咽癌樣品中LINC00312的表達較高。將臨床病理參數中的年齡、性別、組織學類型、臨床分期、腫瘤大小及浸潤范圍、有無淋巴結轉移及LINC00312表達情況進行多變量分析（Cox’s?proportional?hazards?model），分析這些參數與鼻咽癌病人預后的關系，結果顯示LINC00312表達能作為鼻咽癌患者獨立的預后因子，在沒有侵襲轉移的患者中LINC00312表達高預后較好，而有侵襲轉移的患者中LINC00312表達高反而預后差。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及長鏈非編碼RNA基因LINC00312的應用方法。
技術介紹
鼻咽癌是一種上皮源性的多基因遺傳性腫瘤，具有明顯的種族和地域差異，臨床表現復雜多變，發病機制還不十分清楚，治療效果也不理想，五年生存率仍徘徊在50%左右。如何揭示鼻咽癌發生發展的分子機制、發現其預后的特異性分子標志物、預測鼻咽癌患者的預后，從而實現對鼻咽癌患者的預后判定，采用不同的針對性治療方案，實現對鼻咽癌患者的個體化治療，最終提高五年生存率、降低死亡率，是目前值得臨床科研工作者們研究的重要課題。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, IncRNA)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，研究發現很多IncRNA在腫瘤的發生發展中有重要調節作用，它具有抑制腫瘤生長和促進腫瘤轉移等生物學作用。IncRNA根據其基因位置可分為五種類型:正義 IncRNA(sense IncRNA)、反義 IncRNA(antisense IncRNA)、雙向 IncRNA(bidirectionalIncRNA)、基因內 IncRNA(intronic IncRNA)及基因間 IncRNA(intergenic IncRNA) 之前一直被認為是轉錄“噪音”的IncRNA，因在基因調節中的重要功能，目前已成為繼miRNA之后非編碼RNA領域又一研究熱點。近年的研究已表明，IncRNA參與X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程。IncRNA有望成為腫瘤診斷、治療和預后新的標志物，同時也為腫瘤的治療提供了新的靶點。LINC00312是一個長的基因間非編碼RNA，位于染色體3ρ25.3，3p25.3-26.3是一個與鼻咽癌發生密切相關的 染色體等位基因共同缺失區域。我們利用顯微切割技術獲得純凈的鼻咽癌組織樣本，抽提RNA 后通過逆轉錄，實時定量PCR，檢測了 LINC00312在鼻咽癌組織中的表達情況，結果顯示LINC00312在鼻咽癌組織中表達下調(Ρ〈0.001)。我們隨后又利用鼻咽癌組織微陣列技術，通過原位雜交的方法，在大樣本中驗證了 LINC00312在鼻咽癌中表達顯著下調(Ρ〈0.001)。ROC曲線分析發現LINC00312表達能很好區分鼻咽癌患者和非癌患者，因此LINC00312的檢測制劑可用于鼻咽癌的輔助診斷。且LINC00312表達與臨床進展及腫瘤大小呈負相關，但與淋巴結轉移呈正相關，生存曲線分析發現在無淋巴結轉移的鼻咽癌患者中LINC00312陽性表達的患者其總生存率和無病生存率高于LINC00312陰性表達的患者，而在有淋巴結轉移的鼻咽癌患者中，LINC00312陽性表達的患者其總生存率和無病生存率低于LINC00312陰性表達的患者。多因素分析則證實LINC00312是鼻咽癌預后的獨立判斷因素。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供LINC00312基因的應用方法，利用該基因可以制備用于鼻咽癌輔助診斷或者預后預測的制劑。所述的用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的制劑包括原位雜交檢測試劑和實時定量PCR檢測試劑。根據該基因序列設計并合成用于原位雜交的寡核苷酸探針，具體序列如下:5' -ctactataaggaaaagcactatcttctccc-3'5'-gccttaggtcagattctactagtttaaagc-3'5' -agactggttgtctgccccatagtagttgtc-3'。根據該基因序列設計并合成出用于實時定量PCR的檢測引物，具體序列如下:用于實時定量PCR檢測的上、下游引物分別為5 ’ -AAGCGAACCAAGCCAATA-3 ’和5， -CAAATCCCTGAAACTCTG-3，。 申請人利用顯微切割技術獲得純凈的鼻咽癌或正常鼻咽上皮組織樣本，抽提RNA后逆轉錄，熒光實時定量PCR檢測了 LINC00312表達，結果顯示LINC00312在鼻咽癌組織中表達下調(P〈0.001)。并通過原位雜交也發現LINC00312在鼻咽癌中表達顯著下調，與臨床進展及腫瘤大小呈負相關，與淋巴結轉移呈正相關，LINC00312表達能很好區分鼻咽癌患者和非癌患者，有明顯的統計學差異。另外，LINC00312的表達與預后密切相關，多因素分析發現LINC00312可作為預測鼻咽癌預后的獨立預后因素。提示LINC00312可作為鼻咽癌預后預測的分子標志。本專利技術為鼻咽癌的輔助診斷和預后預測提供了強有力的分子生物學工具，具有深遠的臨床意義和推廣性。附圖說明圖1為正常鼻咽上皮組織和鼻咽癌組織顯微切割圖片；a正常鼻咽上皮組織；b正常鼻咽上皮組織顯微切割后；c鼻咽癌組織；d鼻咽癌組織顯微切割后；圖2為LINC00312在經顯微切割后的40例正常鼻咽上皮組織和100例鼻咽癌組織中實時定量PCR結果；圖3為兩個各含448個不同組織點的鼻咽癌發病不同階段組織微陣列；圖4為組織微陣列各組織點對應標本的臨床資料數據庫；圖5為原位雜交檢測LINC00312在鼻咽癌(a)及非癌鼻咽上皮組織中的表達(b);圖6為ROC分析結果；顯示LINC00312的表達可用于區分鼻咽癌和正常鼻咽上皮，從而可以用于鼻咽癌的輔助診斷，具有較高的靈敏度和特異性圖7根據有無轉移及LINC00312表達水平將鼻咽癌患者分組，不同分組病人的預后曲線。A無淋巴結轉移的鼻咽癌患者中，LINC00312陽性表達(+ )的患者其無病生存率高于LINC00312陰性表達(_)的患者；B無淋巴結轉移的鼻咽癌患者中，LINC00312陽性表達(+ )的患者其總生存率高于LINC00312陰性表達(_)的患者；C有淋巴結轉移的鼻咽癌患者中，LINC00312陽性表達(+ )的患者其無病生存率低于LINC00312陰性表達(-)的患者；D有淋巴結轉移的鼻咽癌患者中，LINC00312陽性表達(+ )的患者其總生存率低于LINC00312陰性表達(_)的患者。具體實施例方式以下結合具體實施方式進一步說明本專利技術，而非限制本專利技術。一、熒光實時定量PCR1.材料與方法:40例正常鼻咽上皮組織和100例鼻咽癌組織經Leica ASLMD (Leica MicrosystemsLtd.;ffetzlar, Germany)顯微切割純化后(圖1 )，抽提總RNA, 2 μ g RNA經逆轉錄成cDNA后，進行熒光實時定量PCR。GAPDH引物為5' -GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3'(見序列表第9條序列)和5' -AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3'(見序列表第10條序列)，LINC00312引物為5’ -AAGCGAACCAAGCCAATA-3’(見序列表第 7 條序列)和 5’ -CAAATCCCTGAAACTCTG-3’。(見序列表第8條序列)熒光實時定量PCR反應體系SYBR Premix Ex Taq (2x)10μ1PCR Forward Primer (ΙΟμιη)0.4μ1PCR Reverse Primer (IOpm)0.4μ1cDNA lift2.0μ1dii^O7.2μΙ Total20μ1熒光實時定量PCR反應步驟I 94 0C5min2 95本文檔來自技高網...
【技術保護點】
長鏈非編碼RNA基因LINC00312的應用方法，其特征在于，根據該基因序列制備用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的制劑。
【技術特征摘要】
1.長鏈非編碼RNA基因LINC00312的應用方法，其特征在于，根據該基因序列制備用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的制劑。2.根據權利要求1所述的應用方法，其特征在于，所述的用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的制劑包括原位雜交檢測試劑和實時定量PCR檢測試劑。3.根據權利要求2所述的應用方法，其特征在于，根據該基因序列設計并合成用于原位雜交的寡核苷酸探針。4.根據權利要求3所述的應用方法，其特征在于，用于原位雜交的寡核苷酸探針序列包括:5' -ctactataaggaaa agc...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李桂源，張文玲，黃琛，曾朝陽，熊煒，李小玲，李夏雨，范松青，石磊，譚琛，黃東海，趙艷華，
申請(專利權)人：中南大學，
類型：發明
國別省市：
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