一種木聚糖酶、其編碼基因xyn?lxy及其應用制造技術

本發明專利技術屬于基因工程領域，具體涉及一種木聚糖酶、其編碼基因

【技術實現步驟摘要】
一種木聚糖酶、其編碼基因xyn-lxy及其應用
本專利技術屬于基因工程領域，具體涉及一種木聚糖酶、其編碼基因xyn-lxy及其應用。
技術介紹
木聚糖是植物細胞壁半纖維素的主要成分，在自然界含量豐富，無論在人類日常飲食中還是在畜禽日糧組成上，植物性纖維都占據了相當大的比例。但是人體以及單胃動物消化道內缺少降解半纖維素的酶，無法對木聚糖進行有效的降解，因而增加了消化道食糜的黏性，干擾小腸絨毛對營養物質的吸收和利用。反芻動物瘤胃內含有大量的微生物，對木聚糖具有一定的降解能力，是獲取新型木聚糖酶的重要發掘源。目前已經從瘤胃內分離獲得大量編碼木聚糖酶基因的微生物，但是只有活性高、穩定性好的木聚糖酶應用到工業生產中，以達到提高飼料轉化率和改善動物生長性能的目的。而近年來的研究發現，木聚糖酶的水解產物——低聚木糖對人體健康有著重要的意義，在消化道內可激發雙歧桿菌和乳酸菌大量增殖，抑制腸道腐敗菌的生長，改善腸道微生態環境，從而增強機體的免疫力。除此之外，低聚木糖還具有的難消化、熱量低的特性，在機體代謝過程中不易轉成脂肪和膽固醇，降低了心腦血管疾病突發的可能性。因此低聚木糖在功能性保健品的應用上具有較大的開發空間。通常木聚糖酶的水解產物含有木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖，木糖的產量決定了木聚糖酶是否具有生產低聚木糖的開發價值，液相色譜法能夠利用物質在載體和固定相中分配系數的差別來將其高效、高速分離，這為檢測木聚糖酶水解產物和測定酶解效率提供了保障，能準確評估木聚糖酶在功能性保健品行業中應用前景。由于酶解產物的多樣性及木糖產量原因，目前市場上還沒有專門生產低聚木糖的酶(系)供應。因此，尋找活性良好、低聚木糖產量高的木聚糖酶基因尤為重要。
技術實現思路
本專利技術提供一種木聚糖酶基因，其原核表達后水解產物只有木二糖和木糖，較為單一，且木二糖的產量高，能降工業生產的成本。本專利技術解決其技術問題所采用的技術方案是：一種木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。一種編碼所述木聚糖酶的木聚糖酶基因xyn-lxy，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本專利技術木聚糖酶基因xyn-lxy克隆自湖羊瘤胃微生物Fosmid文庫，具有高效產功能性低聚木糖功能。高效液相色譜檢測其酶解產物主要是木二糖和木糖，未檢測到其它低聚木糖，其中木二糖的酶解效率每U可生產0.25100mg，是木糖產率的3.33倍，產物單一、木二糖產率高是該酶的優勢。一種包含所述木聚糖酶基因xyn-lxy的重組載體。一種包含所述木聚糖酶基因xyn-lxy的轉基因細胞系。一種包含所述木聚糖酶基因xyn-lxy的重組菌。一種制備木聚糖酶的方法，是發酵培養所述的重組菌，得到木聚糖酶。一種所述的重組菌在制備飼料添加劑中的應用。擴增所述木聚糖酶基因xyn-lxy采用的特異性引物為：LXY-F：5’CCGGAATTCATGATCTTCGCCCAGTGCGG3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，LXY-R：5’CCGCTCGAGTTATACCAGCTTGGCGTTACCAA3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.4。本專利技術所述木聚糖酶基因xyn-lxy的獲取方法如下：a、木聚糖酶基因xyn-lxy的克隆及重組質粒pET-30a/xyn-lxy的構建；b、重組質粒pET-30a/xyn-lxy在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達；c、重組蛋白Xyn-LXY的誘導、純化及酶學特性分析；d、重組酶Xyn-LXY水解產物高效液相色譜分析。作為優選，步驟a木聚糖酶基因xyn-lxy的克隆及重組質粒pET-30a/xyn-lxy的構建過程具體如下：①PCR擴增木聚糖酶編碼基因xyn-lxy；②限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切目的片段和表達載體pET-30a；③構成重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞。本專利技術所克隆的基因來自湖羊瘤胃微生物Fosmid文庫，保證基因的新穎性。本專利技術進行PCR擴增目的片段時采取的是自行設計的特異性引物，可以有效保證擴增效率和產物特異性；本專利技術進行了酶的定量分析并將酶解時間延長至96h，能準確計算出酶解效率和生產低聚木糖的最佳時間。本專利技術的木聚糖酶96h水解產物只有木二糖和木糖，產物較單一，木二糖產量高，生產功能性低聚木糖具有優勢；該木聚糖酶反應速率快，僅需2h可使低聚木糖的生產效率達到最高。附圖說明圖1是xyn-lxy木聚糖酶基因的克隆及表達策略；圖2是克隆xyn-lxyPCR產物；圖3是重組蛋白Xyn-LXY的SDS-PAGE分析圖；圖4是重組蛋白Xyn-LXY的WesternBlot鑒定；圖5是pH對Xyn-LXY酶活性的影響；圖6是Xyn-LXY酶的pH穩定性；圖7是溫度對Xyn-LXY酶活性的影響；圖8是Xyn-LXY酶的熱穩定性；圖9是木糖及標準低聚木糖的HPLC圖譜；圖10是Xyn-LXY酶解產物液相分析。具體實施方式下面通過具體實施例，對本專利技術的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本專利技術的實施并不局限于下面的實施例，對本專利技術所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本專利技術保護范圍。在本專利技術中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設備和原料等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。實施例：一、xyn-lxy基因的克隆及重組質粒pET-30a/xyn-lxy的構建xyn-lxy木聚糖酶基因的克隆及表達策略如圖1所示，方法如下：①設計含有EcoRⅠ和XhoⅠ兩個限制性酶切位點的引物:LXY-F：5’CCGGAATTCATGATCTTCGCCCAGTGCGG3’，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，LXY-R：5’CCGCTCGAGTTATACCAGCTTGGCGTTACCAA3’，核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。②PCR擴增Fosmid文庫中含xyn-lxy基因的陽性質粒，擴增體系如下：渦旋振蕩混勻，稍離心后放入PCR儀中。xyn-lxy基因的擴增條件如下：PCR結果見圖2，擴增得到1923bp的條帶，泳道中無其它雜帶出現，說明設計引物的特異性良好。③目的基因質粒與pET-30a載體雙酶切混勻后37℃酶切過夜。酶切結束后清洗回收。④目的基因與pET-30a載體連接20μl體系，目的基因與表達載體摩爾比為7:1，4℃過夜連接。二、重組質粒在大腸桿菌中的表達熱激轉化取10μl連接產物與大腸桿菌感受態BL21(DE3)小心混勻，冰浴30min；42℃水浴熱激60s，立即取出冰浴2-3min；加入890μl37℃預熱的SOC溶液，150rpm恒溫培養1h；吸取60μl轉化后的菌液，涂布于含卡那霉素篩選培養基中，37℃恒溫培養12-16h；挑取菌斑進行菌液PCR鑒定，確認為陽性的克隆子轉接到含卡那霉素的LB液體培養基中擴大培養。三、陽性菌株的誘導、純化及酶學特性分析①陽性菌株的誘導吸取10μl陽性菌液轉接至5mL含卡那霉素(100μg/mL)的LB液體培養基中，37℃，226rpm培養12-14h。將5mL菌液轉接至100mLLB液體培養基中，37℃，226rpm繼續培養至OD＝0.5-1.0(大約8小時)。加入100μlIPTG(終濃度1mmol/L)，25℃，150本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種木聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?No.?2所示。

【技術特征摘要】
1.一種木聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一種編碼權利要求1所述木聚糖酶的木聚糖酶基因Xyn-LXY，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.一種包含權利要求2所述木聚糖酶基因Xyn-LXY的重組載體。4.一種包含權利要求2所述木聚糖酶基因Xyn-LXY的轉基因細胞系。5.一種包含權利要求2所述木聚糖酶基因Xyn-LXY的重組菌。6.一種制備木聚糖酶的方法，是發酵培養權利要...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王佳堃，羅陽，何波，劉建新，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：浙江;33