鱉甲DNA檢測試劑盒及鑒定方法技術

本發明專利技術涉及中藥鑒定技術領域，具體為一種鱉甲DNA檢測試劑盒及鑒定方法。一種鱉甲DNA檢測試劑盒包括樣本前處理液及脫鈣液，線粒體DNA提取體系，PCR反應體系，結果觀察體系四部分組成。一種鱉甲DNA鑒定方法，包括檢測樣本前處理，線粒體DNA提取，PCR引物設計與合成，建立PCR反應，結果判定五步。判斷標準為同時出現1000bp和500bp條帶為正品鱉甲，只出現一條或不出現均為偽品鱉甲本發明專利技術建立的多重PCR鑒定方法具有簡便、快速、檢測結果可靠等優點，能夠準確同時區別鑒別鱉甲和偽品的特異性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及中藥材鑒定技術，具體地說是一種鱉甲DNA檢測試劑盒及鑒定方法。
技術介紹
鳘甲為鳘科的動物鳘(Trionyx sinensis Wiegamann)的背甲，又名:別甲、團甲殼、上甲、王八蓋子、鱉殼、鱉蓋子、水魚殼等。其原動物為中華鱉，俗稱團魚、甲魚、王八等，屬于爬行綱(Repitlia);龜鳘目(Testudinata);鳘科(Tironychidae);鳘屬(Peodiscus)。在我國除西藏、青海及新疆以外其他地區均有分布，以長江流域和華南地區最為多見。我國中華鱉養殖產量居世界之首，但20世紀90年代以來，大量境外走私鱉涌入多我國，加上各養殖場相互之間引種、倒種極不規范，不注重培育品種，嚴重危害了中華鱉的種質資源，種質是產業的源頭，影響到鱉甲的資源，影響到鱉甲的用藥。鱉甲性味咸、微寒，歸肝、腎經。始載于《神農本草經》，列為中品。鱉甲中含有多種成分，主要含有動物膠，角蛋白，碘質，維生素D，磷酸鈣，鱉甲多糖，多種氨基酸和多種微量元素等。豐富的成分使鱉甲的藥用價值很高。具有滋陰潛陽，退熱除蒸，軟堅散結等功能，用于陰虛發熱，骨蒸勞熱，陰虛陽亢，頭暈目眩，虛風內動，手足瘈瘋，經閉，癥瘕，久瘧瘧母。為常用中藥之一，在臨床應用廣泛，除臨床的配方使用外，尚在復方鱉甲軟肝片、人參鱉甲煎丸、參桂鹿茸丸等數種中成藥中應用。《中國藥典》(2010年，一部)中的鑒別方法為:性狀鑒別和浸出物鑒別。文獻中尚有顯微鑒別、理化鑒別、光譜鑒別、色譜鑒別、生化鑒別等，但這些方法尚不能對鱉甲進行快速、有效的鑒別。分子遺傳標記技術開始與中藥領域滲透，并快速融合、發展，其中DNA指紋圖譜在中藥材(除礦物藥外)的鑒定方面具有專屬性強，準確性高，重復性好等優點，從分子水平解決了以前中藥鑒定中宏觀鑒定水平上的不完善。現代分子生物學在中藥的質量控制領域逐步擴大，方法逐漸完善，大大加快了中藥現代化的進程。線粒體是存在于真核細胞內的一種細胞器，線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是一共價閉合的雙鏈環狀的遺傳物質，具有分子量小、結構簡單、易于分離、拷貝數高、突變率高、進化速度快、母性遺傳、無組織特異性、高保守性等特點。其中細胞色素b (cytochrome b, cyt b)基因和細胞色素 C 氧化酶亞基 I (cytochrome c oxidase subunitI,CO I)基因存在于所有動物中，進化速度適中，較短的一個片段就能包含從種內到種間信息，且其DNA序列很少存在插入和缺失，能夠保證足夠交異，是分析種內和近緣種間遺傳多樣性和進化關系的適當的DNA片段，可應用于生物的分類、系統發育和遺傳多樣性的研究。這兩個片段的基因可被作為動物中物種鑒定標記進行研究，因此，以線粒體DNA分子特征為遺傳標記的中藥鑒定更為準確、可靠。我們依托吉林省科技 廳(2008年I月立項)和吉林省教育廳資助課題(2010年I月立項):《中藥DNA指紋檢測試劑盒的研究與開發》(2012年5月吉林省科技廳鑒定成果)，基于線粒體DNA建立動物中藥材的DNA指紋特征，成功開發出紹心、鹿鞭和鹿茸三種中藥材DNA鑒定試劑盒。貂心屬細貴藥材，是國家藥監局局標準(原衛生部部頒標準)利心丸中的主藥。目前，國家標準中尚無貂心的法定鑒別方法，對貂心的成分研究及鑒別國內外文獻中也未見報道，常用中藥材鑒別方法無法區別貂心與易混動物的心臟，故給貂心及其制劑的質量控制帶來了很大困難。課題組在發現貂心線粒體DNA的全部基因組前提下，利用貂心mtDNA獨特的優勢，應用DNA擴增技術及測序技術研究貂心線粒體DNA的基因組部分序列，設計的寡核苷酸片段可特異鑒定雞心、鴨心、鵝心和兔心，成功專利技術了一種簡便、快速、特異的鑒定貂心專利技術(貂心DNA檢測試劑盒及鑒定方法，專利技術專利:ZL200810051643.3 ;2011.4授權)。相關成果發表在吉林大學學報《貂組織線粒體DNA及細胞色素b鑒定及特征》[2008，34(5):790-793]，中國藥學雜志《水貂心肌線粒體mtDNA鑒定及RFLP特征》[2012,4(3):182-185]。在此基礎上，課題組應用分子生物學與中藥鑒定的相融合的理論對鱉甲的鑒定技術進行研究，主要應用線粒體DNA的cyt b高保守性及特異性對鱉甲進行鑒定。采用鹽析法方法從鱉甲中提取線粒體DNA，利用Genbank中的相關信息，根據中華鱉與其他相關動物的線粒體DNA序列的差異,選取cyt b基因序列,應用primer premier5.0引物設計軟件設計鱉甲一對特異性引物，進行PCR(聚合酶鏈式反應)擴增，此方法可從分子水平對鱉甲鑒定提供依據。相關成果發表在中國藥學雜志《中藥材龜甲細胞色素b特異性鑒定研究》[2012，4(3):182-185]。國內杜胃$等人通過對細胞色素C氧化酶亞基I (cytochrome c oxidase subunitI，CO I)基因序列對比研究發現，中華鱉CO I基因序列種內變異很小，種間存在較多的變異位點，可以作為DNA條形碼技術鑒別鱉甲杜鵑，崔麗娜，張輝，等:鱉甲及其偽品的DNA分子鑒定.世界科學技術-中醫藥現代化，2011，13(2) =429-434.。實驗證明了中華鱉CO I基因可以作為鑒別靶位。但是，DNA條形碼技術要求至少選擇兩個基因位點，單獨選擇一個位點不能避免突變導致的變異。劉忠權等人利用位點特異性PCR技術，配合測序技術鑒別鱉甲及其同科動物劉重權，等.中藥材鱉甲的位點特異性PCR鑒定研究.中藥材，2001，32(8) =736-739.;吳平，等.用聚合酶鏈反應產物直接測序技術鑒定中藥材鱉甲.中國藥科大學學報，1998，29 (I):28-30.。實驗證明了中華鱉一些基因位點可以通過特異性PCR和測序技術進行鑒別。在此基礎上，本專利技術專利基于同時選擇兩個特異位點用于中華鱉鑒別。從中華鱉CO I基因和cyt b基因中，采用高通量技術分析兩個基因具有鑒別序列片段作為鑒別點。建立多重引物PCR(又稱復合PCR)反應體系。多重PCR具有高效性特點，即在同一 PCR反應管內同時檢出多種目的基因，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一個樣本就可檢測多種項目。由于鱉甲型別較多，種間存在較多的變異位點，多重PCR可提高其檢出率并同時鑒定其型別及突變等。此外，多重PCR具有經濟簡便性特性，多種目的基因在同一反應管內同時檢出，將大大的節省時間，節省試劑，節約經費開支。對中藥材鑒定具有節約樣本等優勢，具有節省時間、降低成本和提高效率的特點。
技術實現思路
本專利技術專利采用生物信息學技術對中華鱉鱉甲線粒體DNA基因組進行篩選，利用Genbank中的相關信息，根據中華鱉與其他相關動物的線粒體DNA序列的差異，選取COX I和cyt b基因序列,應用primer premier5.0設計軟件,設計可有效地區分鳘甲和偽品的特異性DNA序列，利用多重PCR技術在一個反應體系中加入二對特異性引物，針對一個模板可擴增二個具有差異的目的片段。提供一種能夠準確鑒別鱉甲和偽品特異性分子標志，使用方便的鱉甲和偽品多重PCR檢測試劑盒，具有節省時間、降低成本和提高效率的特點，并提供其簡便、快速、檢測結果可靠的鑒定方法。本專利技術的目的是由本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鱉甲DNA檢測試劑盒，其特征是，它包含樣本前處理液及脫鈣液、線粒體DNA提取體系、PCR反應體系、結果觀察體系。(1)樣本前處理液及脫鈣液(a)前處理液：去離子水。(b)脫鈣液：0.5mol/L?pH8.0EDTA。(2)線粒體DNA提取體系(a)裂解液：10m?mol/L?Tris?HCl(pH8.0)，10m?mol/L?EDTA(pH8.0)，100m?mol/L?NaCl，2％SDS，40μg/ml蛋白酶K，0.039mol/L?DTT。(b)沉淀液：飽和NaAC。(c)洗滌液：70％乙醇。(3)PCR反應體系(a)鑒定反應體系：總體系為100μL，其中含有緩沖液10μL，12.5mM?dNTP4～10μL，0.1mM鱉甲COX?I引物和cyt?b引物各1.5～4.0μL，Taq?DNA聚合酶2～10μL，待測樣品DNA2～5μL，余為雙蒸餾水；(b)陽性對照反應體系：總體系為100μL，其中含有緩沖液10μL，12.5mM?dNTP4～10μL，0.1mM鱉甲COX?I引物和cyt?b引物各1.5～4.0μL，Taq?DNA聚合酶2～10μL，中華鱉鱉甲DNA2～5μL，余為雙蒸餾水；(c)陰性對照反應體系：總體系為100μL，含有緩沖液10μL，12.5mM?dNTP4～10μL，0.1mM鱉甲COX?I引物和cyt?b引物各1.5～4.0μL，Taq?DNA聚合酶2～10μL，偽品DNA2～5μL，余為雙蒸餾水；(4)結果觀察體系(a)瓊脂糖凝膠：1.5％瓊脂糖。(b)標準分子量：100bp～1500bp的DNA?Marker(可以選用其它種類的標準分子量，要求最大的不能超過2000bp，要含有1000bp和500bp)。...

【技術特征摘要】
1.一種鱉甲DNA檢測試劑盒，其特征是，它包含樣本前處理液及脫鈣液、線粒體DNA提取體系、PCR反應體系、結果觀察體系。(1)樣本前處理液及脫鈣液 (a)前處理液:去離子水。(b)脫鈣液:0.5mol/L ρΗ8.0EDTA0 (2)線粒體DNA提取體系(a)裂解液:10mmol/L Tris-HCl (ρΗ8.0)，IOm mol/L EDTA(ρΗ8.0)，100m mol/L NaCl，2% SDS,40y g/ml 蛋白酶 K，0.039mol/L DTT。 (b)沉淀液:飽和NaAC。 (c)洗滌液:70%乙醇。 (3)PCR反應體系 (a)鑒定反應體系:總體系為100μ L，其中含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待測樣品DNA2 5 μ L,余為雙蒸懼水； (b)陽性對照反應體系:總體系為IOOyL,其中含有緩沖液10yL，12.5mMdNTP4 10μ L,0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中華鱉鱉甲DNA2 5 μ L，余為雙蒸餾水； (c)陰性對照反應體系:總體系為100μ L，含有緩沖液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM鱉甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，偽品DNA2 5 μ L,余為雙蒸懼水； (4)結果觀察體系 (a)瓊脂糖凝膠:1.5 %瓊脂糖。 (b)標準分子量:100bp 1500bp的DNAMarker (可以選用其它種類的標準分子量，要求最大的不能超過2000bp，要含有IOOObp和500bp)。2.鱉甲DNA鑒定方法，其特征是，它包含檢測樣本前處理、線粒體DNA提取、PCR引物設計與合成、建立PCR反應、結果判定五個步驟。(1)檢測樣本前處理 每個樣品取2g，刷洗干凈后用前處理液沖洗干凈，室溫干燥，用紫外燈照射30min以上。使用研缽將樣品研碎至2 3mm左右，置于離心管中，每份按質量體積比1: 20加入相應體積脫鈣液，56°C水浴48h 60h，轉速100r/min。每12h更換一次新鮮的脫鈣液。脫隹丐后8000r/min離心5min棄上清,沉淀待用。(2)線粒體DNA提取 (a)樣本裂解向經過前處理的樣品中加入5ml裂解液，置于水浴鍋中，56°C水浴過夜，轉速 100r/min。(b)沉淀直接向裂解后的樣品中加入2ml沉淀液，充分混勻,6，000r/min4°C離心lOmin，吸取上清， 棄沉淀。向上清中加入等體積的預冷的異丙醇，混勻后，低溫放置20 30min, 12, 000r/min4°C離心 20min,棄上清，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李明成，苑廣信，張麗華，夏薇，王冰梅，
申請(專利權)人：吉林市雷博科技有限公司，
類型：發明
國別省市：