一種雞Pax7基因31 bp indel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種雞Pax7基因31bp?indel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法及其應(yīng)用，其中檢測(cè)方法包括以下步驟：根據(jù)雞Pax7基因的第3外顯子及第3內(nèi)含子的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)該基因31bp?indel多態(tài)性，當(dāng)?shù)?內(nèi)含子31bp插入時(shí)為II基因型，31bp缺失時(shí)為DD基因型，該位點(diǎn)為雜合的個(gè)體時(shí)，為ID基因型。同時(shí)，本發(fā)明專利技術(shù)利用檢測(cè)結(jié)果與雞經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，用于雞的輔助選擇和分子育種。本發(fā)明專利技術(shù)方法檢測(cè)DNA大片段時(shí)不僅分辨率高，檢測(cè)靈敏，判型準(zhǔn)確，且操作簡(jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間、成本低，可廣泛推廣。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種雞Pax7基因31bp indel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法，同時(shí)還涉及該快速檢測(cè)方法的應(yīng)用，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
動(dòng)物為人類提供了穩(wěn)定的蛋白來(lái)源，是人類生活所必需的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著肉禽業(yè)禽類生長(zhǎng)速度的提高和飼料效率的選育，肉禽的生產(chǎn)性能得到了很大的提高，但同時(shí)也產(chǎn)生了使肉質(zhì)性狀下降的負(fù)面影響，如腹脂的過(guò)多沉積，風(fēng)味的降低，肌纖維直徑變粗、嫩度下降等。我國(guó)是養(yǎng)雞和雞肉消費(fèi)大國(guó)，隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)雞肉的需求不僅僅是產(chǎn)量，更重要的是其風(fēng)味和適口性。因此，在雞的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)蛋率得以改善的同時(shí)，如何提高雞肉品質(zhì)已成為家禽育種工作者的新目標(biāo)。Pax7基因是Pax基因家族中的III組，參與機(jī)體中樞神經(jīng)和骨骼肌的發(fā)育過(guò)程，在骨骼肌的發(fā)育和再生過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。同時(shí)，Pax7基因?qū)τ诩∪獾纳杉胺只及l(fā)揮著非常重要的作用，影響動(dòng)物的生長(zhǎng)性狀。然而，目前，關(guān)于Pax7基因多態(tài)性的研究比較少，在雞上還沒(méi)有Pax7基因多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道。 單核苷酸多態(tài)性即SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)是指在基因組 DNA序列上單個(gè)核苷酸(A，G，C，T)的變化，包括置換、顛換、缺失和插入，從理論上來(lái)看每一個(gè)SNP位點(diǎn)都可以有4種不同的變化形式，但實(shí)際上發(fā)生的只有轉(zhuǎn)換和顛換。SNPs是繼限制性酶切片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)以及可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)和微衛(wèi)星多態(tài)性(SSR)之后的新一代多態(tài)性遺傳標(biāo)記，自1994年第一次被提出之后，它漸漸成為了與分子標(biāo)記有關(guān)的各領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。對(duì)于單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(以一種嘧啶置換另一種嘧啶或一種嘌呤置換另一種嘌呤)以及顛換(嘌呤與嘧啶互換)所引起多態(tài)性的檢測(cè)方法，最常見(jiàn)的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(SSCP)、PCR-RFLP和直接測(cè)序技術(shù)等。但SSCP操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，影響因素較多，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在假陰性問(wèn)題，所以，并非理想的SNP檢測(cè)手段；普通的PCR-RFLP方法要求待測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)是某一特定酶切位點(diǎn)，應(yīng)用范圍局限；直接測(cè)序技術(shù)成本較高。且上述方法不適用于基因組DNA幾十個(gè)堿基的插入/缺失多態(tài)的檢測(cè)，對(duì)于基因組DNA序列插入缺失的檢測(cè)，許多研究運(yùn)用了 PCR-RFLP方法或PCR與聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)相結(jié)合的方法，PCR-RFLP方法需要一種針對(duì)突變位點(diǎn)的特殊的內(nèi)切酶，且酶切產(chǎn)物最終還需用瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)，成本較高，耗時(shí)長(zhǎng)。PCR與聚丙烯酰胺檢測(cè)的方法可以檢測(cè)基因幾個(gè)堿基序列的插入/缺失，但對(duì)于幾十個(gè)bp的插入/缺失來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。總之，需要探索一種快速檢測(cè)基因組DNA序列中幾十個(gè)核苷酸插入/缺失多態(tài)的檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種雞Pax7基因31bp indel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案是提供一種雞Pax7基因31bpindel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法，包括以下步驟:I)根據(jù)雞Pax7基因的第3外顯子及第3內(nèi)含子的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物；2 )以包含雞Pax7基因的DNA序列為模板，利用步驟I)設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雞Pax7基因31bp indel的核苷酸多態(tài)性，當(dāng)?shù)?內(nèi)含子包含31bp插入時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶，條帶大小為588bp，命名為II基因型；當(dāng)?shù)?內(nèi)含子31bp缺失時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶，條帶大小為557bp，命名為DD基因型；當(dāng)該位點(diǎn)為雜合的個(gè)體時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶，條帶大小分別為588bp和557bp，命名為ID基因型。所述31bp indel位點(diǎn)位于雞Pax7基因序列的第3194-3224區(qū)域，其中雞Pax7基因序列的GenBank登錄號(hào):NC_006108。所述一對(duì)引物為:上游引物:5’-CTnTTCTCTCTCCCCTTCC-3'；下游引物:5’-CAGACCCTCAGCACAACTCA-3'。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:包含雞Pax7基因序列的DNA50ng，10 u mo I/L的上下游引物各1.0 ii L，2 X Taq PCR Master Mixl2 U L,滅菌超純水 10.5u L0PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，72°C退火、延伸60s，72°C充分延伸IOmin,其中，變性、退火、延伸循環(huán)30次。所述瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所用的瓊脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5-2%。本專利技術(shù)的目的還在于提供一種雞Pax7基因31bp indel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法的應(yīng)用。本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案還在于提供一種雞Pax7基因31bp indel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法的應(yīng)用，所述的檢測(cè)方法可用于雞的輔助選擇和分子育種。通過(guò)將基因型與雞的不同性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，確定基因與性狀的對(duì)應(yīng)關(guān)系，用于雞的分子育種。所述性狀為經(jīng)濟(jì)性狀，包括生長(zhǎng)性狀、屠宰性狀和肉質(zhì)性狀。雞Pax7基因31bp indel位于雞Pax7基因擴(kuò)增目的片段588bp的364-394位置上(第 3 內(nèi)含子)，II 基因型插入了 31bp 的 ‘AAAGTAGGGTCGAGGGGACGTCAGCCCATGG’序列，DD基因型相應(yīng)位置缺失了 31bp的‘AAAGTAGGGTCGAGGGGACGTCAGCCCATGG’序列。在F2資源群體中，Pax7基因31bp indel的I等位基因頻率為0.511，D等位基因頻率為0.489。Pax7基因31bp indel多態(tài)性與雞經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析表明:31bp indel多態(tài)性與雞的大部分重要生產(chǎn)性狀有顯著關(guān)聯(lián)，I等位基因即31bp的插入利于雞的生長(zhǎng)，D等位基因即31bp的缺失不利于雞的生長(zhǎng)發(fā)育，但有利于提高肉質(zhì)質(zhì)量。本專利技術(shù)采用PCR與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合的方法，檢測(cè)Pax7基因中31bp indel的多態(tài)性，相對(duì)于PCR-RFLP方法，節(jié)約了購(gòu)買內(nèi)切酶的成本，且大大節(jié)約了酶切的時(shí)間；又克服了聚丙酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜的局限性。本專利技術(shù)的檢測(cè)方法檢測(cè)DNA大片段時(shí)不僅分辨率高，檢測(cè)靈敏，判型準(zhǔn)確，且操作簡(jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間、成本低，可廣泛推廣。因此，PCR-瓊脂糖凝膠電泳方法是一種檢測(cè)基因組DNA序列幾十個(gè)核苷酸插入缺失的非常理想的遺傳標(biāo)記方法。本專利技術(shù)的檢測(cè)方法是一種在DNA水平上篩查和檢測(cè)與雞生長(zhǎng)性狀密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，以用于雞的輔助選擇和分子育種，對(duì)提高雞的生長(zhǎng)性狀具有重要的作用。附圖說(shuō)明圖1為雞Pax7基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為雞Pax7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3為雞Pax7基因31bp插入基因型測(cè)序圖，其中箭頭下劃線部分表示‘AAAGTAGGGTCGAGGGGACGTCAGCCCATGG’ 序列的插入；圖4為雞Pax7基因31bp缺失基因型測(cè)序圖，其中箭頭處表示‘AAAGTAGGGTCGAGGGGACGTCAGCCCATGG’ 序列的缺失；圖5為雞Pax7基因31bp indel基因型序列分析圖。`具體實(shí)施例方式動(dòng)物材料:固始雞、安卡雞固始雞屬于我國(guó)黃雞類型的一種優(yōu)良地方品種，它以固始縣為中心，在非凡的生態(tài)環(huán)境和飼養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期閉鎖繁衍而自然形成。固始雞是蛋肉兼用型雞種，具有優(yōu)良的性狀:一是耐粗飼，抗病力強(qiáng)，適宜野外放牧散養(yǎng)；二本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種雞Pax7基因31bp?indel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：1）根據(jù)雞Pax7基因的第3外顯子及第3內(nèi)含子的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物；2）以包含雞Pax7基因的DNA序列為模板，利用步驟1）設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3）通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雞Pax7基因31bp?indel的核苷酸多態(tài)性，當(dāng)?shù)?內(nèi)含子包含31bp插入時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶，條帶大小為588bp，命名為II基因型；當(dāng)?shù)?內(nèi)含子31bp缺失時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶，條帶大小為557bp，命名為DD基因型；當(dāng)該位點(diǎn)為雜合的個(gè)體時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶，條帶大小分別為588bp和557bp，命名為ID基因型。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種雞Pax7基因31bp indel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)根據(jù)雞Pax7基因的第3外顯子及第3內(nèi)含子的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物； 2)以包含雞Pax7基因的DNA序列為模板，利用步驟I)設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雞Pax7基因31bpindel的核苷酸多態(tài)性，當(dāng)?shù)?內(nèi)含子包含31bp插入時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶，條帶大小為588bp，命名為II基因型；當(dāng)?shù)?內(nèi)含子31bp缺失時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶，條帶大小為557bp，命名為DD基因型；當(dāng)該位點(diǎn)為雜合的個(gè)體時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶，條帶大小分別為588bp和557bp，命名為ID基因型。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞Pax7基因31bpindel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述31bp indel位點(diǎn)位于雞Pax7基因序列的第3194-3224區(qū)域，其中雞Pax7基因序列的GenBank登錄號(hào):NC_006108。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞Pax7基因31bpindel多態(tài)性的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述一對(duì)引物為: 上游引物:5’-CmTTCTCTCTCCCCTTCC-3’ ； 下游引物:5’ -CAGACCCTCAGCACAACTC...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：康相濤，張鎖，韓瑞麗，王樂(lè)樂(lè)，田亞?wèn)|，孫桂榮，李國(guó)喜，蔣瑞瑞，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：