用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物、探針、試劑盒及方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物和探針組合、含有該引物和探針組合的試劑盒以及采用該引物和探針組合或試劑盒進(jìn)行人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性檢測(cè)的熒光PCR方法。本發(fā)明專利技術(shù)基于TaqMan熒光PCR技術(shù)，簡單、快捷，靈敏度高。此外，本發(fā)明專利技術(shù)通過合理的引物和探針搭配，有效避免了引物與引物之間、引物與探針之間以及探針與探針之間的相互作用，減少了檢測(cè)誤差。本發(fā)明專利技術(shù)提供的引物、探針和試劑盒用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性具有敏感度高、特異性強(qiáng)、操作簡易快速、安全、結(jié)果判讀簡單直觀并且可直接使用血液樣品或者濾紙干血片樣品作為模板等優(yōu)勢(shì)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物、探針、試劑盒及方法
本專利技術(shù)涉及基因工程
，具體涉及用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物、探針、試劑盒及方法。
技術(shù)介紹
華法林是臨床上常用的抗凝藥物，是深靜脈血栓、心房纖顫、心臟瓣膜置換術(shù)和肺栓塞等疾病的一線用藥。但是華法林治療窗很窄：藥劑量小了，不能阻止血栓形成；劑量大了，又會(huì)導(dǎo)致出血，患者的最適用藥量表現(xiàn)出明顯的個(gè)體差異。目前已知與華法林藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)相關(guān)基因達(dá)30余種，其中維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1(VitaminKepoxidereductasecomplexsubunit1，VKORC1)和細(xì)胞色素P4502C9(CytochromeP4502C9，CYP2C9)基因多態(tài)性是華法林個(gè)體劑量差異的主要影響因素。CYP2C9基因存在野生型CYP2C9*1和突變型CYP2C9*2～CYP2C9*13，其中與華法林代謝最密切的突變型為CYP2C9*2(rs1799853)和CYP2C9*3(rs1057910)，這2個(gè)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致CYP2C9活性降低。CYP2C9*2型等位基因在中國人中極少發(fā)現(xiàn)，CYP2C9*3型的頻率為3％。CYP2C9*3純合子和雜合子基因型個(gè)體S-華法林的口服清除率分別下降了90％和66％，因此按常規(guī)劑量給藥會(huì)造成華法林血藥濃度長時(shí)間維持在較高水平，導(dǎo)致患者出血風(fēng)險(xiǎn)增加。維生素k氧化還原酶(VKORC1)是華法林的作用靶點(diǎn)，VKORC1在其啟動(dòng)子區(qū)存在-1639G>A位點(diǎn)多態(tài)性(rs9923231)。大量研究發(fā)現(xiàn)，VKORC1啟動(dòng)子的基因多態(tài)性是影響華法林需求劑量中種族差異和個(gè)體差異的最主要因素。與該位點(diǎn)AA基因型患者相比，-1639GA和GG基因型患者平均華法林劑量分別增加52％和102％。美國FDA2010年修改華法林說明書，建議結(jié)合VKORC1和CYP2C9基因型考慮華法林的初始用藥劑量。臨床上也可根據(jù)考慮了VKORC1和CYP2C9基因型、年齡、身高、體重、種族、是否合用肝藥酶誘導(dǎo)劑和是否合用胺碘酮等因素的劑量計(jì)算公式確定華法林初始用藥劑量。目前臨床應(yīng)用的基因多態(tài)性檢測(cè)方法主要有四種：直接測(cè)序法，PCR-基因芯片法，PCR-溶解曲線法和熒光定量PCR法。測(cè)序法雖然為基因多態(tài)性檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是由于其需要的檢測(cè)時(shí)間長，操作復(fù)雜，并且靈敏度不高；PCR-基因芯片法的操作要求高，雜交和洗片都必須避光操作，并且芯片價(jià)格昂貴；PCR-溶解曲線法無特異性，并不能精確定位基因變化位置，并且只是因單個(gè)堿基差異造成的Tm差異不是很明顯，通常會(huì)造成在溶解曲線上的峰不是很清晰，因而這三種方法在臨床上的推廣都存在一定困難。傳統(tǒng)熒光定量PCR法在臨床上應(yīng)用較為廣泛，該方法對(duì)樣本數(shù)量以及多態(tài)性分布有一定要求，樣本量少時(shí)不能對(duì)樣本基因多態(tài)性進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性還無法滿足高效、精準(zhǔn)、簡便等要求，同時(shí)還需要對(duì)樣品進(jìn)行基因組DNA提取等繁瑣復(fù)雜的操作流程，所以亟需一種快速、有效、精準(zhǔn)且無需DNA提取的檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，基于最新的科研動(dòng)態(tài)和臨床應(yīng)用，重新設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物、探針以及方法。本專利技術(shù)的檢測(cè)方法簡便快速、精準(zhǔn)有效、結(jié)果簡單易辨別且對(duì)于小樣本依然適用，甚至直接利用血液樣品或?yàn)V紙干血片樣品為模板進(jìn)行檢測(cè)也能得到很好的結(jié)果。為此，本專利技術(shù)一方面提供了一種用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物和探針組合，其中引物序列如序列1-4所示，探針序列如序列5-8所示，引物序列1-2以及探針序列5-6用于檢測(cè)VKORC1基因的多態(tài)性，引物序列3-4以及探針序列7-8用于檢測(cè)CYP2C9基因的多態(tài)性。在本專利技術(shù)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該引物和探針組合中，探針的5’端有FAM或VIC修飾，3’端有NFQ-MGB修飾。在本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該引物和探針組合中，每條引物的濃度為300nM，每條探針的濃度為200nM。本專利技術(shù)基于最新的科研動(dòng)態(tài)和臨床應(yīng)用，重新設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物和探針。所設(shè)計(jì)的引物Tm值均在60℃附近，整合搭配各個(gè)引物，從而盡量避免了引物二聚體的產(chǎn)生。同時(shí)選用MGB探針使得Tm值均在70℃附近，避免了探針與其他非特異性序列之間的結(jié)合，同時(shí)也避免了探針相互之間形成復(fù)雜的二聚體，提高了熒光PCR擴(kuò)增的特異性和效率。針對(duì)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的檢測(cè)，本專利技術(shù)設(shè)計(jì)的具體引物和探針情況如表1和表2所示。表1、VKORC1基因檢測(cè)的引物和探針情況表表2、CYP2C9基因檢測(cè)的引物和探針情況表本專利技術(shù)另一方面提供了一種用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒，其包含本專利技術(shù)所述的引物和探針組合。在本專利技術(shù)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本專利技術(shù)的試劑盒中還包含陽性對(duì)照液和空白對(duì)照液，所述陽性對(duì)照液為分別含有三種不同VKORC1等位基因和兩種不同CYP2C9等位基因的五種細(xì)胞系DNA，所述空白對(duì)照液為TE緩沖液。本專利技術(shù)另一方面提供了本專利技術(shù)所述的引物和探針組合在制備檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性試劑盒中的應(yīng)用。本專利技術(shù)再一方面提供了本專利技術(shù)所述的引物和探針組合，或者本專利技術(shù)所述的試劑盒在檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性中的應(yīng)用。本專利技術(shù)最后一方面提供了一種檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的方法，其包含以下步驟：1、獲取待測(cè)樣品基因組DNA、直接使用待測(cè)血液樣品、或者直接使用待測(cè)濾紙干血片樣品。當(dāng)待測(cè)樣品為基因組DNA時(shí)，DNA的提取可以采用TIANGEN或者QIAGEN公司的DNA提取試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作即可。當(dāng)待測(cè)樣品為血液樣品時(shí)，需要將血液與超純水按照1：2的比例進(jìn)行稀釋，并混勻震蕩，直接向反應(yīng)孔中加入1ul即可。當(dāng)待測(cè)樣品為濾紙干血片樣品時(shí)，直接將血液混勻后滴在濾紙上風(fēng)干，用打孔取樣器取出一片放入反應(yīng)孔中即可。2、采用本專利技術(shù)所述的引物和探針組合，或者采用本專利技術(shù)所述的試劑盒，以步驟1中獲取的基因組DNA、血液樣品或者濾紙干血片樣品為模板，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。3、收集熒光信號(hào)，將數(shù)據(jù)結(jié)果直接導(dǎo)入美國應(yīng)用生物學(xué)技術(shù)公司開發(fā)的基因分型專業(yè)分析軟件TaqManGenotyper中進(jìn)行分析。在本專利技術(shù)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本專利技術(shù)直接使用待測(cè)血液樣品或者待測(cè)濾紙干血片樣品為模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。在本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，20ul熒光PCR反應(yīng)體系包括：10ul的熒光PCR緩沖液、1.2ul的引物混合液、0.8ul的探針混合液、0.2ul的UNG酶、0.1ul的ROXReferenceDye、1ul的DNA模板或血液模板(模板為濾紙干血片時(shí)只需一片即可)以及6.7ul的Nuclease-FreeWater。所述熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃預(yù)處理3分鐘，95℃預(yù)變性15分鐘，預(yù)變性后按照以下程序進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95℃15秒，60℃32秒；50℃數(shù)據(jù)讀取1分鐘；如果模板為血液樣品或者濾紙干血片樣品，則將循環(huán)數(shù)增至45。由上述描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具備如下優(yōu)點(diǎn)。1、與現(xiàn)有的其它基因多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物和探針組合，其中引物序列如序列1?4所示，探針序列如序列5?8所示，引物序列1?2以及探針序列5?6用于檢測(cè)VKORC1基因的多態(tài)性，引物序列3?4以及探針序列7?8用于檢測(cè)CYP2C9基因的多態(tài)性。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的引物和探針組合，其中引物序列如序列1-4所示，探針序列如序列5-8所示，引物序列1-2以及探針序列5-6用于檢測(cè)VKORC1基因的多態(tài)性，引物序列3-4以及探針序列7-8用于檢測(cè)CYP2C9基因的多態(tài)性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和探針組合，其中探針的5’端有FAM或VIC修飾，3’端有NFQ-MGB修飾。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物和探針組合，其中每條引物的濃度為300nM，每條探針的濃度為200nM。4.一種用于檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物和探針組合。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中還包含陽性對(duì)照液和空白對(duì)照液，所述陽性對(duì)照液為分別含有三種不同VKORC1等位基因和兩種不同CYP2C9等位基因的五種細(xì)胞系DNA，所述空白對(duì)照液為TE緩沖液。6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物和探針組合在制備檢測(cè)人類VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性試劑盒中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭仲征，安琳，芮立，尤開，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：深圳荻碩貝肯精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)有限公司，上海荻碩貝肯醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，上海荻碩貝肯生物科技有限公司，上海荻碩貝肯生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東,44