用于檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種的靶基因及試劑盒制造技術

本發明專利技術提供了用于檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種的靶基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發明專利技術還提供了實時熒光定量PCR引物和探針，引物和探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.2，SEQ?ID?NO.3，SEQ?ID?NO.4。本發明專利技術還提供了檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種的試劑盒。本發明專利技術的檢測方法及其試劑盒具有檢測準確，靈敏度高、特異性強，簡便快速的優點，最低檢測限為每個PCR反應11個拷貝，具有良好的臨床標本檢測能力。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子生物學領域，特別是涉及用于檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種的靶基因以及檢測該基因的引物和探針，本專利技術還涉及利用該引物和探針進行文森巴爾通體博格霍夫亞種檢測的試劑盒。
技術介紹
文森巴爾通體博格霍夫亞種(Bartonellavinsonii subsp.berkhoffii, Bvb)是一種能夠引起犬心內膜炎、紫癜性肝炎、心肌炎和肉芽腫性淋巴結炎等疾病的革蘭陰性桿菌，也可以引起人心內膜炎和神經系統疾病等。1993年，此菌首先分離自一只患有心內膜炎的病犬，是巴爾通體屬中新發現的人獸共患病病原菌。文森巴爾通體博格霍夫亞種(Bvb)具有巴爾通體屬菌的共同特征，較難培養，對培養條件要求較高、培養時間長。目前，國內外對此菌的檢測方法主要是分離培養、間接免疫熒光法(IFA)檢出血清抗體和常規PCR檢測核酸分子。分離培養方法雖然能夠獲得直接的感染證據，但是由于文森巴爾通體博格霍夫亞種難于培養、生長緩慢，又由于樣品取材限制，培養成功率較低，不適用于快速診斷、篩查和流行病學調查。血清學檢測方法中，國際上通常應用IFA法檢測巴爾通體抗體，有些種如漢賽巴爾通體和五日熱巴爾通體有市售的檢測試劑盒，對于文森巴爾通體博格霍夫亞種國外僅有個別實驗室能夠進行，而且應用全菌作為檢測抗原存在交叉反應，另外IFA法判讀有一定的主觀性，不易于推廣使用和結果比較。常規PCR雖然避免了上述兩類方法的缺陷，但是方法的敏感性和可能存在污染是不得不考慮的問題。熒光定量PCR方法由于其靈敏度高、自動化程度高等優點，能夠很好地解決上述問題，在傳染病病原檢測上日漸普及，因此有必要建立熒光定量PCR方法檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種。目前，國內外尚未見應用TaqMan探針熒光定量PCR方法檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種的報道。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的在于提供用于檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種的靶基因。本專利技術的第二個目的在于提供針對上述靶基因的特異性引物和探針；本專利技術的第三個目的在于提供檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種的試劑盒。 基于以上目的，本專利技術應用3S 引物(S15:5, -GGAGGGTGTT-3' , S18:5/ -CCACAGCAGT-3'，S103:5' -AGACGTCCAC-3')擴增文森巴爾通體博格霍夫亞種等巴爾通體基因組，發現Bvb的F帶在其他巴爾通體對應位置上無擴增帶，測序后在NCBI上比對發現與其相似性最大的是五日熱巴爾通體(B.quintana, Bq)的argF (78%),其他還有格拉漢姆巴爾通體(B.grahamii, Bg)和特利波契巴爾通體(B.tribocorum, Bt) (67%)。本專利技術針對文森巴爾通體博格霍夫亞種的保守基因序列(SEQID N0.1所示)設計引物和TaqMan探針，并將獲得的特異性引物和探針在NCBI數據庫進行比對，以排除引物-探針與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優化后的引物、探針序列。本專利技術提供的優選的引物序列為:上游引物:CACACAACCCCATATCTCATTCG，下游引物:CATGCTGTATCGGCTATGGTTTT。探針序列序列為:FAM-CACACACCAGCTTTG-MGB。本專利技術提供一種文森巴爾通體博格霍夫亞種的實時熒光定量PCR檢測方法，包括以樣品總DNA為模板，利用本專利技術提供的引物和探針進行實時熒光定量PCR，同時設立無模板對照和陽性對照，根據擴增曲線判定結果。本專利技術提供了一種用于檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種的試劑盒，其包括上述能特異地擴增出如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列或其特異性片段的特異性引物以及配合引物使用的Taqman探針。本專利技術試劑盒的引物序列為:上游引物:CACACAACCCCATATCTCATTCG，下游引物:CATGCTGTATCGGCTATGGTTTT。探針序列序列為: FAM-CACACACCAGCTTTG-MGB。本專利技術提供的試劑盒，還可進一步包括DNA裂解液，熒光定量反應液，陰性模板和陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為文森巴爾通體博格霍夫亞種基因組DNA。本專利技術的試劑盒，其20 μ L總工作體系為:本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種（Bartonella?vinsoniisubsp.berkhoffii）的靶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?IDNO.1所示。

【技術特征摘要】
1.一種用于檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種(Bartonella vinsoniisubsp.berkhoffii)的靶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。2.一種用于檢測文森巴爾通體博格霍夫亞種的特異性引物，其特征在于，其擴增產物為權利要求1所述靶基因。3.如權利要求2所述的特異性引物，其特征在于，其核苷酸序列為: 上游引物:5 ’ -CACACAACCCCATATCTCATTCG-3，， 下游引物:5’ -CATGCTGTATCGGCTATGGTTTT-3’。4.與權利要求2或3所述特異性引物配合使用的熒光探針。5.如權利要求4所述的熒光探針，其核苷酸序列為:FAM-CACACACCAGCTTTG-MGB。6.含有權利要求2或3所述引物和/或權利要求4或5...

【專利技術屬性】
技術研發人員：栗冬梅，劉起勇，
申請(專利權)人：中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，
類型：發明
國別省市：