本發明專利技術提供一種結核分枝桿菌TB檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mM/L，氯化鉀20～300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針。使用本發明專利技術試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法的檢測結果沒有明顯差異，而本發明專利技術中提取核酸時采用強烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放出病原體核酸，無需加熱即可完成DNA的釋放和提取；本發明專利技術試劑盒檢測TB的靈敏度可達400copies/ml，定量線性范圍為400～4.00E+09copies/ml；應用該試劑盒可以對痰液等未知樣本中的TB-DNA進行快速準確的檢測，為診斷TB感染提供可靠的實驗依據。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術提供一種結核分枝桿菌(TB)檢測試劑盒，具體是一種基于熒光PCR的TB-DNA檢測試劑盒。
技術介紹
結核分枝桿菌是結核病的病原菌，本菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見；目前全球每年約出現8百萬結核新病例，并導致約3百萬人死亡；我國每年死于結核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數總和的兩倍多；因此，結核病又成為了威脅人類健康的全球性衛生問題，并成為某些發展中國家和地區，特別是艾滋病高發區人群的首要死因。目前我國對結核病的臨床診斷主要通過痰涂片鏡檢和細菌分離培養。痰涂片鏡檢法簡單、快速，但靈敏度和特異度都達不到要求，而且受實驗室條件、實驗人員鏡檢技術水平的影響較大；此外，涂片法的檢測精度大約為50%且無法檢出耐藥菌株。細菌分離培養是結核病診斷的金標準，但耗時長，快速生長菌也至少需7天才有陽性結果，時間長者甚至需要數周，而且由于標本處理過程可能導致細菌死亡，產生假陰性結果。另外，免疫學和血清學技術也因其低靈敏度和特異性而受到限制。隨著分子生物學的飛速發展，越來越多的分子生物學方法應用于檢測結核分枝桿菌，主要包括PCR診斷、DNA指紋技術等。而隨著FQ-PCR技術的發展，其在結核病早期診斷領域的應用已越來越廣泛，也越來越為人所重視，結核病感染的實驗診斷中，實時熒光PCR技術憑借著快速、敏感、特異等優點顯示出了其臨床診斷的優越性。運用熒光PCR技術檢測TB-DNA主要包括TB核酸的提取和核酸的PCR擴增兩方面。目前國內臨床上主要采用直接煮沸法對樣本中的TB核酸進行提取，該方法核酸提取過程較復雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時，樣本中的DNA存在損耗，尤其對高濃度的樣本裂解不充分、富集不完全，會造成DNA的大量丟失導致樣本定量偏低。國外臨床上主要采用某種DNA提取試劑盒來提取TB核酸，其提取效果較好，但是由于價格昂貴，難以在國內應用。臨床上檢測TB-DNA的方法目前主要是基于實時熒光定量PCR的技術及其改進，實時熒光定量PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴增儀，熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平，試驗結束后可通過軟件自動分析獲得擴增曲線，根據擴增曲線與熒光閾值線的交點(即Ct值)以及擴增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結果；如果同一反應中有已知濃度的定量參考品或標準品，則可以通過軟件自動分析獲得標準曲線，由此實現對未知樣本的定量檢測。與傳統的PCR相比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，熒光報告基團發出的熒光能量被淬滅基團吸收，呈現淬滅效應；如果擴增過程中有靶序列的存在，隨著目標片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉移效應，熒光報告基團發出的熒光信號被熒光檢測裝置收集。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。試驗結束后，可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動分析數據，可以獲得陰陽性結果和樣本濃度的定值結果，因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。目前國內外已有基于實時熒光定量PCR技術定量檢測TB-DNA的試劑盒應用于臨床檢測中，但這些試劑盒多半以煮沸法提取核酸，且其檢測靈敏度不高，約在1-10個TB菌左右。
技術實現思路
本專利技術提供一種核酸釋放劑在結核分枝桿菌TB檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.θΓθ.5mM/L，氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01 2%和乙醇 0.05 1%。在本專利技術所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領域常用的，例如為無菌水或TE緩沖液。本專利技術首次披露在結核分枝桿菌TB檢測中使用含強蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡化了該菌檢測的步驟，而且檢測靈敏度有了很大的提高。本專利技術提供一種結核分枝桿菌TB檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.θΓθ.5mM/L，氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.0Γ2%和乙醇0.05^1% ;所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針。使用本專利技術試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測結果沒有明顯差異，而 本專利技術中提取核酸時采用強烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放出病原體核酸，無需加熱即可完成DNA的釋放和提取；本專利技術試劑盒檢測TB的靈敏度可達400copies/ml,定量線性范圍為400 4.00E+09copies/ml。具體的，用于靶多核苷酸的上游引物序列為5’ -ACGGATAGGGGATCTCAGTACAC-3’，下游引物序列為 5’ -CGTCTCGGCTAGTGCATTGTC-3’，探針序列為 5’ -FAM-TTCCGACCGCTCCGACCGAC-BHQ1-3’。需要說明的是，探針中FAM表示該探針羧基端使用FAM熒光基團標記，BHQl表示羥基端用BHQl淬滅基團修飾。本專利技術的試劑盒因采用用于檢測靶多核苷酸的上述引物和/或探針序列，具有很好的特異性。本專利技術中，優選所述試劑盒中還包括內標，所述內標的序列為5’ -GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3 ’。本專利技術中所述內標為插入pUC18T載體的一段長為97堿基對的人工合成DNA序列的重組體，即質粒，它作為PCR擴增體系中的陽性內對照，預防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質導致的假陰性。在所述試劑盒中包含內標的情況下，所述PCR反應液中還包括用于內標檢測的上游引物、下游引物和探針；內標上游引物序列為5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’，內標下游引物序列為 5’-ACAAACGGGCAACATACCTTG_3，內標探針序列為5’ -HEX-TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’。同樣的，探針中HEX表示其羧基端使用HEX熒光基團標記。優選本專利技術所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產物，利用UNG酶和PCR反應液中的dUTP可以起到預防PCR產物污染的作用，從而防止樣本檢測假陽性。在一個具體實施方式中，所述試劑盒中還包括TB定量參考品、TB陽性對照和TB陰性對照。本專利技術還提供一種TB檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針，且用于靶多核苷酸的上游引物序列為5’ -ACGGATAGGGGATCTCAGTACAC-3’，下游引物序列為5’-CGTCTCGGCTAGTGCATTGTC-3。本專利技術又提供一種TB檢測本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種核酸釋放劑在結核分枝桿菌TB檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1%。
【技術特征摘要】
1.一種核酸釋放劑在結核分枝桿菌TB檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.θΓθ.5mM/L，氯化鉀 2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉 0.01 2% 和乙醇 0.05 1%。2.一種結核分枝桿菌TB檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.θΓθ.5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.0f 2%和乙醇0.05^1% ;所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游弓I物和用于靶多核苷酸檢測的探針。3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的上游引物序列為5’ -ACGGATAGGGGATCTCAGTACAC-3’，用于靶多核苷酸的下游引物序列為5’-CGTCTCGGCTAGTGCATTGTC-3’ 。4.根據權利要求2或3所述的檢測試劑盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的探針序列為5’-FAM-TTCCGACCGCTCCGACCGAC-BHQ1-3’ 。5.根據權利要求2 4中任意一項所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內標，所述內標序列為 5，-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3，。6.根據權利要求5所述的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：戴立忠，鄧中平，吳康，
申請(專利權)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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