本發(fā)明專利技術提供了一種用于檢測結核分枝桿菌的特異性引物和探針組合，采用微滴數(shù)字PCR技術檢測全血中結核分枝桿菌特有的,而其他細菌和人體不具有的目的基因Rv1768的拷貝數(shù)含量。具有快速、敏感、特異等優(yōu)點，可用于結核分枝桿菌檢測和預防中。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及試劑盒檢測
，具體的說涉及一種檢測結核分枝桿菌的微滴數(shù)字PCR絕對定量檢測試劑盒。
技術介紹
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)，俗稱結核桿菌，是引起人結核病的主要病原菌，其感染引起的結核病(Tuberculosis，TB)是全球三大傳染病殺手之一。據(jù)2015年最新流行病學統(tǒng)計，全球2014年新增結核病例約960萬人，并導致約150萬人死亡。全球約有將近1/3的人口感染過結核分枝桿菌，其中90-98％為潛伏感染，其中的2-10％會發(fā)展為活動性結核。近年來，由于耐藥株的流行、艾滋病與結核病聯(lián)合發(fā)病，使結核病的治療難度加大并且嚴重威脅著人類健康。因此早期明確的診斷對于結核病的治療及傳播的控制具有極其重要的意義。目前臨床上應用的結核病診斷技術主要有結核菌素(PPD)試驗、痰細菌培養(yǎng)、抗酸染色、血清學抗體檢測、定量PCR、IFN-γ的ELISpot或T-Spot檢測等方法(Mitchison D A.The diagnosis and therapy of tuberculosis during the past 100years[J].Am J Respir Crit Care Med,2005,171(7):699-706.)。但是以上方法在臨床應用中各有靈敏度低、耗時、或特異性差,或不能檢測T細胞免疫缺陷的感染者等缺點(Mitchison D A.The diagnosis and therapy of tuberculosis during the past100years[J].Am J Respir Crit Care Med,2005,171(7):699-706.)，如PPD試驗的假陽性率高，無法區(qū)分是MTB感染還是卡介苗(BCG)接種；抗體的檢測無法診斷感染早期抗原出現(xiàn)而抗體還未產生的“窗口期”；采用痰涂片等抗酸染色檢測由于痰液取樣均一性較差等因素造成診斷準確性下降，并且該方法靈敏度較低,檢出率僅約為33％(全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組.2000年全國結核病流行病學抽樣調查報告[J].中國防癆雜志,2002(02):3-46.)。由于血液中結核分枝桿菌含量極低，一般技術很難以血液樣本中結核基因進行準確檢測(Lima J F,Guedes G M,Lima J F,Lira L A,Santos F C,Arruda M E,Montenegro L M,Schindler H C.Single-tube nested PCR assay with in-house DNA extraction for Mycobacterium tuberculosis detection in blood and urine[J].Rev Soc Bras Med Trop,2015,48(6):731-738.)。最近發(fā)展的實時定量PCR(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)技術具有較快速、靈敏度高、特異性較強的優(yōu)點，qPCR技術檢測的是結核特異基因的含量，但樣本通常僅是限于病人痰液而不是血液(由于血液中結核菌含量很低)，或對少數(shù)免疫低下病人血液(血液中結核菌含量高于正常人的)的檢測。qPCR要求目的基因拷貝數(shù)相對較高，對目的基因做出相對定量分析，可能會出現(xiàn)假陽性(如探針保存不當而部分降解)和假陰性結果(對于低拷貝數(shù)時)。并且在分析外源基因拷貝數(shù)時必須依賴于標準曲線和已知拷貝數(shù)的基因，而標準曲線的制備容易受各種因素的影響，故此法對診斷標準的統(tǒng)一性仍值得商榷。因此，亟待開發(fā)新型、有效的結核病診斷方法，特別是亟需開發(fā)結核早期診斷試劑、和嬰幼肺結核和肺內外結核診斷新方法。微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是近年來興起的一種新的核酸絕對定量技術，又稱為第三代PCR技術。ddPCR技術通過將微量樣品極度稀釋實現(xiàn)理論上的單分子擴增。與qPCR相比，ddPCR不需要通過CT值來計算目的基因的拷貝數(shù)，所以擴增效率并不會對結果產生影響。通過相應儀器對反應結果進行測量后，可以直接通過計數(shù)的方法或者使用泊松分布的統(tǒng)計學方法來得到樣本的具體濃度。該技術的提出僅僅只有十幾年的光景，但是它的進步與發(fā)展卻相當迅速。ddPCR兼具qPCR方法的優(yōu)點，其相對qPCR具有更高的靈敏度和更多元分析的能力，為臨床診斷提供獨特的分析優(yōu)勢，并且也不需要標準曲線的制備。ddPCR已經(jīng)報道用于拷貝數(shù)很低的石蠟包埋肝組織中HBV(Hepatitis B Virus，HBV)的檢測(Huang J T,Liu Y J,Wang J,Xu Z G,Yang Y,Shen F,Liu X H,Zhou X,Liu S M.Next generation digital PCR measurement of hepatitis B virus copy number in formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissue[J].Clin Chem,2015,61(1):290-296.)。目前，ddPCR已被用于病毒的分析及腫瘤分子標志物稀有突變的檢測，與疾病相關的基因拷貝數(shù)變異檢測以及其他病原微生物的檢測RNA和基因表達分析等，對HIV感染者體內HIV病毒DNA低拷貝檢測靈敏度也有針對性報道(Persaud D,Gay H,Ziemniak C,Chen Y H,Piatak M J,Chun T W,Strain M,Richman D,Luzuriaga K.Absence of detectable HIV-1viremia after treatment cessation in an infant[J].N Engl J Med,2013,369(19):1828-1835.)。因此，ddPCR在復雜的異質樣品中的稀有序列檢測方面具有明顯的技術優(yōu)勢，能夠完成很多qPCR無法完成的檢測任務。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是提供一種檢測結核分枝桿菌的微滴數(shù)字PCR絕對定量檢測試劑盒，用于結核分枝桿菌的高靈敏度、高特異性、快速、定量精確檢測。本專利技術的第一個技術目的是提供用于檢測結核分枝桿菌的特異性引物和探針，其核苷酸序列分別為：Rv1768-F:5’CGGCAACAGATTTGGCGAACA3’(Seq ID No:2)；Rv1768-R:5’CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3’(Seq ID No:3)；Rv1768-P:5’-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQ1-3’(Seq ID No:4)；本專利技術提供了上述特異性引物和探針組合在制備結核分枝桿菌檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。本專利技術提供了一種含有上述特異性引物和探針組合的試劑盒。所述試劑盒優(yōu)選為微滴數(shù)字PCR絕對定量檢測試劑盒。本專利技術的另一個技術目的在于提供一種具有檢測結核分枝桿菌的微滴數(shù)字PCR絕對定量檢測試劑盒，其中包含一對特異性引物和1條探針，其核苷酸序列分別為：Rv1768-F:5’CGGCAACAGATTTGGC本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種用于檢測結核分枝桿菌Rv1768的特異性引物和探針組合，其特征在于，核苷酸序列分別為：Rv1768?F:5’CGGCAACAGATTTGGCGAACA3’(Seq?ID?No:2)；Rv1768?R:5’CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3’(Seq?ID?No:3)；Rv1768?P:5’?FAM?TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG?BQ1?3’(Seq?ID?No:4)。
【技術特征摘要】
1.一種用于檢測結核分枝桿菌Rv1768的特異性引物和探針組合，其特征在于，核苷酸序列分別為：Rv1768-F:5’CGGCAACAGATTTGGCGAACA3’(Seq ID No:2)；Rv1768-R:5’CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3’(Seq ID No:3)；Rv1768-P:5’-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQ1-3’(Seq ID No:4)。2.一種含有權利要求1所述的特異性引物和探針組合的結核分枝桿菌檢測試劑盒。3.如權利要求2所述的試劑盒，其為微滴數(shù)字PCR絕對定量檢測試劑盒。4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，包含一對特異性引物和1條探針，其核苷酸序列分別為：Rv1768-F:5’CGGCAACAGATTTGGCGAACA3’(Seq ID No:2)；Rv1768...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：章曉聯(lián)，譚楊，宋能，
申請(專利權)人：武漢大學，
類型：發(fā)明
國別省市：湖北;42
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