本發明專利技術提供一種解脲脲原體（UU）檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針。使用本發明專利技術試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法的檢測結果沒有明顯差異，而本發明專利技術中提取核酸時采用強烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放出病原體核酸，無需加熱即可完成DNA的釋放和提??；本發明專利技術試劑盒檢測UU的靈敏度可達400copies/ml，檢測線性范圍為400~4.00E+10copies/ml；應用該試劑盒可以對生殖道分泌物等未知樣本中的UU-DNA進行快速準確的檢測，為診斷解脲脲原體感染提供可靠的實驗依據。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術提供一種解脲脲原體(UU)檢測試劑盒，具體是一種基于熒光PCR的UU-DNA檢測試劑盒。
技術介紹
解脲脲原體又稱解脲支原體(UU)，屬于柔膜綱支原體目支原體科的脲原體屬，是一類介于細菌與病毒之間的最小原核微生物，主要分布于人體泌尿生殖道內，并通過性接觸而傳播，也可由母體垂直傳染給胎兒。男性生殖道最常見的寄生處在尿道口和精液中，女性生殖道最常見的寄生處在陰道。解脲脲原體是非淋菌性尿道炎的主要病原體之一，感染后可導致多種生殖道炎癥。在男性可導致非淋菌性尿道炎、急性附睪炎、前列腺炎等的發生；在女性可引起子宮內膜炎、輸卵管炎、卵巢炎等，宮內感染可引起流產、死胎、早產等不良后果。近年來，UU作為主要病原體的報道增多，但是許多感染者臨床癥狀不典型，因此，早期、簡便、快速，特異地診斷UU，對臨床的診斷、疾病的早期治療和預防其流行等具有重要的意義。目前解脲脲原體的實驗室診斷方法主要有分離培養法、免疫學方法、基于核酸檢測的分子生物方法等。分離培養法的特異性和敏感性高，但其具有臨床檢測時間過長(至少需要24tT48h，甚至更長時間)，過程繁瑣，需要使用特殊的培養介質以及易受雜菌影響等缺陷，不適用于大范圍檢測。免疫學法具有快速、簡便、靈敏度高等優勢，但受多種因素的影響，目前國內也沒有商品化的試劑盒(僅有一個蛋白芯片檢測系統獲得批準認證)。近年來，聚核酶鏈式反應(PCR)法漸漸顯現了其在檢測上的優勢，熒光PCR技術是基于傳統PCR技術并結合光譜技術而發展起來的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測技術。檢測結果準確，重復性高，能動態反應患者治療前、后病原體動態變化及與臨床的關系，且整個過程中避免了傳統PCR需后處理的問題，減少了污染。實時熒光PCR技術憑借著快速、敏感、特異等優點顯示出了其臨床診斷的優越性。運用PCR技術進行檢測主要涉及到兩個方面，核酸的提取和核酸的擴增檢測。目前國內臨床上主要采用煮沸法對解脲脲原體的核酸進行提取，具體是先將分泌物樣本濃縮、洗滌，再加裂解液，煮沸，高速離心，取上清為模板；該方法核酸提取過程較復雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時，經過煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會造成DNA的大量丟失導致樣本定量偏低，同時由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污；另外，對于濃縮這一步，不同廠家的濃縮效果不一樣，有的可以看到沉淀，有的無法看到，能看到沉淀是因為該步驟將核酸與蛋白都濃縮了，這樣會導致后面加入裂解液時很難充分混勻；無法看到沉淀的則使操作者無法確定吸棄上清時會不會吹打到核酸。臨床上檢測UU-DNA的方法目前主要是基于實時熒光定量PCR的技術及其改進，實時熒光定量PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴增儀，熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平，試驗結束后可通過軟件自動分析獲得擴增曲線，根據擴增曲線與熒光閾值線的交點(即Ct值)以及擴增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結果；如果同一反應中有已知濃度的定量參考品或標準品，則可以通過軟件自動分析獲得標準曲線，由此實現對未知樣本的定值(即定量檢測)。與傳統的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，熒光報告基團發出的熒光能量被淬滅基團吸收，呈現淬滅效應；如果擴增過程中有靶序列的存在，隨著目標片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉移效應，熒光報告基團發出的熒光信號被熒光檢測裝置收集。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。試驗結束后，可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動分析數據，可以獲得陰陽性結果和樣本濃度的定值結果，因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。目前國內外已有基于實時熒光定量PCR技術檢測UU-DNA的試劑盒應用于臨床檢測中，但這些試劑盒多半以煮沸法提取核酸，且其檢測靈敏度不高，約在50(Tl000COpies/ml左右；另外，這些試劑盒大多缺乏完善的質控體系，還需要進一步完善和提高技術水平，使此類產品更加滿足臨床準確診斷的需要。
技術實現思路
本專利技術提供一種核酸釋放劑在解脲脲原體UU檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.θΓθ.5mM/L，氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01 2%和乙醇0.05 1%。在本專利技術所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領域常用的，例如為無菌水或TE緩沖液。本專利技術首次披露在解脲脲原體UU檢測中使用含強蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡化了該核酸檢測的步驟，而且檢測靈敏度有了很大的提高。`本專利技術提供一種解脲脲原體UU檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.θΓθ.5mM/L，氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.0Γ2%和乙醇0.05^1% ;所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游弓I物和用于靶多核苷酸檢測的探針。使用本專利技術試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測結果沒有明顯差異，而本專利技術中提取核酸時采用強烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放出病原體核酸，無需加熱即可完成DNA的釋放和提?。槐緦＠夹g試劑盒檢測解脲脲原體UU的靈敏度可達400copies/ml，檢測線性范圍為400 4.00E+10copies/ml。具體地，用于靶多核苷酸的探針序列為5’ -TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-3’ ；優選用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分別為5’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’ 和 5’ -CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3 ’。本專利技術的試劑盒因采用用于檢測靶多核苷酸的上述引物和/或探針序列，具有很好的特異性。本專利技術中，優選所述試劑盒中還包括內標，所述內標的序列為5’_GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。本專利技術中所述內標為插入PUC18T載體的一段長為97堿基對的人工合成DNA序列的重組體，即質粒，它作為PCR擴增體系中的陽性內對照，預防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質導致的假陰性。在所述試劑盒中包含內標的情況下，所述PCR反應液中還包括用于內標檢測的上游引物、下游引物和探針；且優選內標探針的序列為5’ -TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’ 。優選本專利技術所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產物，利用UNG本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種核酸釋放劑在解脲脲原體UU檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1%。
【技術特征摘要】
1.一種核酸釋放劑在解脲脲原體UU檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.θΓθ.5mM/L，氯化鉀 2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉 0.01 2%和乙醇 0.05 1%。2.一種解脲脲原體UU檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.θΓθ.5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.0f 2%和乙醇0.05^1% ;所述PCR反應液中包含用于靶多核苷酸擴增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測的探針。3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的探針序列為5’-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-3，。4.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物序列分別為:5’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’ 和 5’ -CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3，。5.根據權利要求2 4中任意一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內標，所述內標序列為 5，-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATG...
【專利技術屬性】
技術研發人員：戴立忠，鄧中平，李勃，
申請(專利權)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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