本發明專利技術公開了一種基于毛細電泳的出疹性病原體的多重基因檢測方法，包括如下步驟：(1)生產“出疹性病原體多重基因檢測試劑盒”；(2)采集患者樣品，并提取核酸；(3)以患者核酸為模板進行反轉錄；(4)以反轉錄產物為模板進行PCR反應；(5)以毛細電泳的方法分離樣品。本發明專利技術具有靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種檢測方法，尤其是一種靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的基于毛細電泳的出疹性病原體的多重基因檢測方法。
技術介紹
目前，我國出疹性病原體檢測主要方法有如下幾種1.病原體檢查即直接做影像及活組織檢查 ，或病原體分離培養，之后在顯微鏡、電鏡下觀察，做出診斷。此方法曾一度是微生物檢測的經典方法，也是之后各種檢測方法的基礎平臺，得到各個國家的認可，在我國一直沿用至今。優點成本低；對實驗室硬件要求低。缺點(I)耗時長一般需3-5天或更長。(2)診斷效率低只能單菌純培養；對一些表型特征變異的病原體，用形態學經驗很難辨別；此外，由于抗生素的濫用，細菌在檢測過程中生長受到抑制，導致假陰性的結果。(3)工作量巨大由于對每個抽檢樣品的每種菌都必須進行檢測，工作量非常巨大，特別是部分對培養環境要求較為苛刻的菌，更加大了檢測的工作量和難度。2.免疫學檢查應用最廣泛的是酶聯免疫技術(ELISA):—般先用一抗與抗原發生特異性結合，然后用通用的酶標記的二抗與一抗發生特異性結合，再將酶顯色，之后觀察結果。優點⑴樣品通量較高利用96孔酶標板，一塊平板可完成多個樣品的檢測；⑵較敏感利用酶聯的特性，可將原來的抗原信號放大；(3)快捷在時間上，比傳統的培養基微生物培養檢查法要縮短很多。缺點(1)易出現假陽性由于洗滌和抗原包被的操作，或由于抗原表面決定簇類似而發生交叉反應，故易出現假陽性(2);耗時耗力制作抗體是非常耗時耗力的工作(3);靈敏度不確定實驗的靈敏度取決于抗體的好壞，而每個抗體的好壞不一，質量難以控制；(4)無法檢測多變異的病毒變異性較快的病毒，如甲流病毒，存在多種亞型，并且經常變異，變異導致抗體失效，無法檢測抗原，如禽流感病毒和豬流感病毒等。3.分子生物學-PCR檢測方法。目前經常應用的有實時熒光定量PCR、免疫PCR、反轉錄PCR等，都是針對病原體的特異性靶基因進行檢測。其中，熒光定量PCR檢測方法最為成熟。熒光定量PCR技術的優點靈敏性高，并可精確定量，在對李氏桿菌、沙門氏菌、肉毒桿菌、大腸桿菌等的檢測中都取得了良好效果。2004年，中國發布了實施熒光定量PCR檢測禽流感H7亞型的國家標準。2009年，美國FDA批準了用熒光定量PCR檢測豬流感HlNl亞型的試劑盒。熒光定量PCR的缺點(I)通量低一次只能檢測一個病原成分，如需要檢測多種病原菌，就需要多臺PCR儀同時工作，效率低，周期長，對大批量的多種病原污染的樣品更是無從下手；(2)成本相對較高因一次只能檢測一個病原體，當一個樣品同時需要檢測多種病原菌時，必須一個一個檢測，成本相對增高。4.分子生物學-基因芯片法基因芯片是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。優點(1)高通量并行檢測當一個樣品同時需要檢測多種病原菌時，一次實驗即可得出全部結果；(2)操作簡便快速整個檢測只需4-8小時基本可以出結果。缺點(1)技術成本昂貴、復雜每個樣品需要一個芯片，成本大于YlOOO/樣品，不利于大規模推廣；探針的合成與固定比較復雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；(2)不能精確定量，重復性差；(3)靈敏度較低芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴增，由于引物較多，容易自身產生二聚體，發夾結構，或由于Tm值不同，而導致擴增目的片段效率不同，進而影響檢測的靈敏度；(4)由于芯片的種類較多，難以制定一個統一的質量控制標準。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的基于毛細電泳的出疹性病原體的多重基因檢測方法。本專利技術采用如下技術方案 ，包括如下步驟(I)生產“出疹性病原體多重基因檢測試劑盒”；(2)采集患者樣品，并提取核酸；(3)以患者核酸為模板進行反轉錄；(4)以反轉錄產物為模板進行PCR反應；(5)以毛細電泳的方法分離樣品O優選地，所述步驟(I)中的試劑盒包括反轉錄引物管、PCR引物管、反轉錄緩沖液、PCR緩沖液、25mM氯化鎂、反轉錄酶、DNA聚合酶、熒光標記物、陽性對照。優選地，所述步驟(2)中的患者樣品包括鼻咽拭子、痰液、皰疹液、血液等等。優選地，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后在一定溫度下孵育的子步驟。優選地，所述步驟(3)中的孵育溫度分別為48°C、42°C、95°C、4°C。優選地，所述步驟(4)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進行熱循環反應的子步驟。優選地，所述步驟(4)的子步驟中的熱循環溫度分別為95°C、94°C、60°C、70°C、4。。。本專利技術的有益效果為1.靈敏度高、重復性好采用激光誘導熒光-PMT，具有超高靈敏度。2.準確性強采用毛細管電泳對PCR產物進行分離檢測，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性。3.高通量本系統采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術，實現單個反應檢測15-40個位點，可同時做192個反應(如192個患者樣品，每個樣品檢測14種出診性病原體，23個位點)，一天出結果；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準確報告，避免漏檢。4.精確定量可精確定量病原體基因拷貝數。5.靈活性強可隨時根據需求調整檢測的靶基因。6.成本低每個樣品的檢測成本少于￥50，利于大規模推廣。具體實施方式下面根據實施例對本專利技術作進一步詳細說明。本專利技術創立了一種同步檢測十六種常見出疹性病原體、二十二個靶位的多重基因檢測方案。檢測的病毒包括單純皰疹病毒1，單純皰疹病毒2型，水痘-帶狀皰疹病毒，非洲淋巴細胞瘤病毒，人類巨細胞病毒，人類皰疹6型病毒，人類皰疹7型病毒，腸道病毒及其亞型(柯薩奇病毒A16型和腸道病毒71型)，麻疫病毒，風疫病毒，細小病毒B19, 口蹄疫病毒及其亞型(口蹄疫病毒A型、O型、C型、Asia型、SAT1，2，3)，乙型溶血性鏈球菌，肺炎支原體等(表I)。建立了可靠的樣品質量及反應過程的對照(表I)a)人DNA和人RNA完整性的對照內參確保在檢驗過程中對樣品質量的判斷，避 免假陰性。b)正常反應對照內參監控PCR反應效率，避免假陰性。出疹性病原體多重基因檢測的引物設計(見表2核苷酸序列)表1.檢測的靶位點權利要求1.，包括如下步驟(1)生產“出疹性病原體多重基因檢測試劑盒”；(2)采集患者樣品，并提取核酸；(3)以患者核酸為模板進行反轉錄；(4)以反轉錄產物為模板進行PCR反應；(5)以毛細電泳的方法分離樣品。2.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(I)中的試劑盒包括反轉錄引物管、 PCR引物管、反轉錄緩沖液、PCR緩沖液、25mM氯化鎂、反轉錄酶、DNA聚合酶、熒光標記物、陽性對照。3.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(2)中的患者樣品包括鼻咽拭子、痰液、 皰疹液、血液等等。4.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后在一定溫度下孵育的子步驟。5.根據權利要求4所述的檢測方法，所述步驟(3)中的孵育溫度分別為48°C、42本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于毛細電泳的出疹性病原體的多重基因檢測方法，包括如下步驟：(1)生產“出疹性病原體多重基因檢測試劑盒”；(2)采集患者樣品，并提取核酸；(3)以患者核酸為模板進行反轉錄；(4)以反轉錄產物為模板進行PCR反應；(5)以毛細電泳的方法分離樣品。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳勇，周靜曉，黃迎彬，陳燕芬，
申請(專利權)人：海爾施生物醫藥股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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