本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法，包括如下步驟(1)收集宮頸樣品；(2)樣品DNA提取；(3)以提取的DNA樣品為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。本發(fā)明專利技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈活性強(qiáng)、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種檢測方法，尤其是一種靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈活性強(qiáng)、成本低的人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法及試劑盒。
技術(shù)介紹
人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,簡稱HPV)是一種嗜上皮性病毒，有高度的特異性。根據(jù)致病力強(qiáng)弱，HPV被分為高危型和低危型兩種，“是否能致癌”是危險度大小的主要標(biāo)志。全世界每年宮頸癌的新發(fā)病例大約有500，000，是除乳腺癌之外威脅女性生命健康的第二大惡性腫瘤。HPV和宮頸癌的病因?qū)W關(guān)系已經(jīng)明確，從HPV感染到宮頸癌發(fā)生需要較長時間，在此期間通過檢測可以了解是否感染HPV，早發(fā)現(xiàn)早治療，從而有效預(yù)防宮頸 癌的發(fā)生。目前主要的技術(shù)方法如下1.原位雜交優(yōu)點(diǎn)是特異性好；缺點(diǎn)是操作繁瑣費(fèi)時耗力、需要大量較純的DNA。2. DNA直接捕捉法優(yōu)點(diǎn)是有大量的數(shù)據(jù)支持該技術(shù)的應(yīng)用，能檢測高危型別；缺點(diǎn)是靈敏度低于PCR ;不能確定具體的HPV亞型。3.亞型特異性PCR :優(yōu)點(diǎn)是特異性較好；缺點(diǎn)是勞動強(qiáng)度大。4.通用引物PCR:優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，一次可以擴(kuò)增多種亞型；缺點(diǎn)是不能區(qū)分確定具體HPV的亞型。5. PCR產(chǎn)物直接測序優(yōu)點(diǎn)是在確定目前尚未知道的HPV亞型感染以及突變研究時尤其有用；缺點(diǎn)是不是十分靈敏，特別是對HPV混合感染的臨床樣本更是如此，不宜作為體外診斷方法。6. PCR-酶聯(lián)免疫分析法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高；缺點(diǎn)是樣本消耗大。7. PCR-固相反向雜交法優(yōu)點(diǎn)是效率高、一次實驗可分出多個HPV亞型；缺點(diǎn)是重復(fù)性較差。8.熒光定量PCR:優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、操作方便、耗時短；缺點(diǎn)是通量少、一次只能檢測1-2個亞型、且不能確切分型。9.優(yōu)點(diǎn)是成本相對較低，操作簡單；缺點(diǎn)是可以觀察到細(xì)胞形態(tài)的變化，但不能確定發(fā)生細(xì)胞形態(tài)變化的病因；取樣的部位決定檢測的結(jié)果。綜上，目前的人乳頭瘤病毒(HPV)的主要檢測方法存在操作繁瑣費(fèi)時耗力、靈敏度低、勞動強(qiáng)度大、樣本消耗大、重復(fù)性較差、通量少的缺點(diǎn)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈活性強(qiáng)、成本低的人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法。本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案本專利技術(shù)的一個方面涉及一種人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法，包括如下步驟⑴收集宮頸樣品；⑵樣品DNA提??；(3)以提取的DNA樣品為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。優(yōu)選地，所述步驟(2)包括如下子步驟I)取500 μ L細(xì)胞保存液于1. 5mL EP管中，13000g離心5分鐘,去掉上清液,底部為宮頸脫落細(xì)胞；2)向含有宮頸脫落細(xì)胞的EP管中加入500 μ L裂解液，裂解10分鐘；3)向裂解液中加入100 μ L磁珠吸附游離的DNA ；4)用清洗液將磁珠清洗兩次；5) 100 μ L 洗脫液洗脫 DNA。優(yōu)選地，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)的子步驟。優(yōu)選地，所述步驟⑶的子步驟中的熱循環(huán)溫度分別為94°C、60°C、70°C、4°C。優(yōu)選地，所述步驟(4)包括制備GeXP遺傳分析儀樣品、準(zhǔn)備分離液、毛細(xì)電泳分離樣品、結(jié)果分析的步驟。 本專利技術(shù)的另一方面涉及一種用于上述方法的試劑盒，包括以下試劑引物管、溶液X、PCR緩沖劑、25mM氯化鎂、聚合酶以及陽性對照。本專利技術(shù)的有益效果為1.靈敏度高、重復(fù)性好采用激光誘導(dǎo)熒光-PMT，具有超高靈敏度。2.準(zhǔn)確性強(qiáng)=GeXP采用毛細(xì)管電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測，可將非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴(kuò)增產(chǎn)物分離，最大程度降低假陽性。3.高通量本系統(tǒng)采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術(shù)，實現(xiàn)單個反應(yīng)檢測30-40個位點(diǎn)，可同時做192個反應(yīng)(如192個患者樣品，每個樣品檢測19種呼吸道病毒，22個位點(diǎn))，一天出結(jié)果；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準(zhǔn)確報告，避免漏檢。4.精確定量可精確定量病原體基因拷貝數(shù)。5.靈活性強(qiáng)可隨時根據(jù)需求增加或刪減HPV亞型。6.成本低利于大規(guī)模推廣。具體實施例方式下面根據(jù)實施例對本專利技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本專利技術(shù)創(chuàng)立了一種一次性檢測25種HPV亞型，包括6種低危型6、11、42、43、44、81和 19 種高危型 HPV 亞型 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83的分型定量檢測方案，具體亞型見表I。本專利技術(shù)的25種HPV亞型的特異性引物是針對各亞型基因組上的致癌基因E6/E7設(shè)計的，再通過多重PCR和毛細(xì)電泳的方法，根據(jù)擴(kuò)增片段長度的不同將各亞型分辨出來。建立了可靠的樣品質(zhì)量及反應(yīng)過程的對照(表I)a)人DNA完整性的對照內(nèi)參β -globin :確保在檢驗過程中對樣品質(zhì)量的判斷，避免假陰性。b)正常反應(yīng)對照內(nèi)參pcDNA3.1 (+):監(jiān)控PCR反應(yīng)效率，避免假陰性。2.通過人為加入反應(yīng)內(nèi)參pcDNA3. 1(+)對HPV亞型的拷貝數(shù)進(jìn)行定量。3. 25種HPV分型檢測的引物序列(見表2)。表1.檢測的HPV亞型和反應(yīng)參照權(quán)利要求1.一種人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法，包括如下步驟 (1)收集宮頸樣品； (2)樣品DNA提取； (3)以提取的DNA樣品為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)； (4)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述步驟(2)包括如下子步驟 1)取500μ L細(xì)胞保存液于1. 5mL EP管中，13000g離心5分鐘，去掉上清液，底部為宮頸脫落細(xì)胞； 2)向含有宮頸脫落細(xì)胞的EP管中加入500μ L裂解液，裂解10分鐘； 3)向裂解液中加入100μ L磁珠吸附游離的DNA ； 4)用清洗液將磁珠清洗兩次； 5)100 μ L洗脫液洗脫DNA。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)的子步驟。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，所述步驟(3)的子步驟中的熱循環(huán)溫度分別為94。。、60。。、70。。、4。。。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述步驟(4)包括制備GeXP遺傳分析儀樣品、準(zhǔn)備分離液、毛細(xì)電泳分離樣品、結(jié)果分析的步驟。6.一種用于前述權(quán)利要求中的任一項所述的方法的試劑盒，包括以下試劑引物管、溶液X、PCR緩沖劑、25mM氯化鎂、聚合酶以及陽性對照。全文摘要本專利技術(shù)公開了一種人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法，包括如下步驟(1)收集宮頸樣品；(2)樣品DNA提取；(3)以提取的DNA樣品為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。本專利技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈活性強(qiáng)、成本低的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號C12Q1/68GK102994647SQ20121020656公開日2013年3月27日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日專利技術(shù)者吳勇, 孫婷婷 申請人:寧波海爾施基因科技有限公司本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種人乳頭瘤病毒(HPV)的分型定量檢測方法，包括如下步驟：(1)收集宮頸樣品；(2)樣品DNA提取；(3)以提取的DNA樣品為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳勇，孫婷婷，
申請(專利權(quán))人：寧波海爾施基因科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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