本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種基于實(shí)時(shí)核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增（Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）技術(shù)的腸道病原體快速檢測(cè)技術(shù)，具體提供了一種星狀病毒實(shí)時(shí)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及其一對(duì)引物和一條分子信標(biāo)探針；所述試劑盒包括含有上述引物和探針的2×實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)液、5×酶混合液及陽(yáng)性對(duì)照模板、陰性對(duì)照和空白對(duì)照;所述引物和探針序列是序列編號(hào)為SEQIDNO：1～3所示的序列，能特異性擴(kuò)增和檢測(cè)星狀病毒ORF2基因片段。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的試劑盒具有快速、高效、敏感特異和實(shí)時(shí)檢測(cè)分析等特點(diǎn)，可應(yīng)用于臨床和口岸的常規(guī)檢測(cè)和疾病防控領(lǐng)域。???????
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種基于實(shí)時(shí)核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增（Nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA）技術(shù)的腸道病原體快速檢測(cè)技術(shù)。具體涉及星狀實(shí)時(shí)NASBA等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒；還涉及所述試劑盒中使用的對(duì)于星狀病毒基因組具有特異性的引物對(duì)和分子信標(biāo)探針。
技術(shù)介紹
星狀病毒（Astrovirus，AstV）于1975年由Appleton和Higgins使用電鏡檢測(cè)急性胃腸炎患兒糞便標(biāo)本時(shí)被首次發(fā)現(xiàn)，因病毒顆粒在電鏡下呈現(xiàn)5、6個(gè)角的特征外觀，狀如星形而由Madeley和Cosgrove命名為星狀病毒。星狀病毒是一種分布很廣泛的，導(dǎo)致嬰幼兒、老年人、免疫功能低下或缺失者急性腹瀉的重要病原之一。星狀病毒既可引起散發(fā)和醫(yī)源性感染，也能形成暴發(fā)，有研究發(fā)現(xiàn)它亦是成人腹瀉的重要病原。星狀病毒基因組是單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為6.8?kb，基因組從5’端到3’端順序包括一個(gè)約85個(gè)核苷酸的5’非編碼區(qū)(5’?non-coding?region，NCR)，三個(gè)開(kāi)放讀碼框架(open?reading?frames，ORFs)ORFIa、ORFlb和ORF2，一個(gè)約80個(gè)核苷酸的3’非編碼區(qū)和一個(gè)大約30個(gè)核苷酸的多聚腺苷酸尾。病毒基因組的3’末端具有高度保守的核酸序列(主要包括3’非編碼區(qū))。ORFIa和ORFIb編碼非結(jié)構(gòu)蛋白：ORFIa編碼一個(gè)絲氨酸蛋白酶；ORFIb編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RNA－dependent?RNA?polymerase，RDRP)。ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白為衣殼蛋白前體。盡管與星狀病毒感染有關(guān)的死亡病例十分罕見(jiàn)，但印度曾有過(guò)相關(guān)報(bào)道。大量研究已表明星狀病毒已成為嬰幼兒病毒性腹瀉的第2或第3位重要病原。所以檢測(cè)該病毒的感染情況對(duì)于疾病控制和臨床診斷均具有重要意義。因此，一套簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)的星狀病毒檢測(cè)方法，可以為腹瀉病的防控和臨床診斷提供有力的技術(shù)支持。目前，針對(duì)星狀病毒的檢測(cè)，經(jīng)典的方法有電鏡觀察、細(xì)胞分離培養(yǎng)、核酸雜交、酶聯(lián)免疫等。電鏡觀察不但敏感度低、而且價(jià)格昂貴、設(shè)備和技術(shù)條件要求甚高，無(wú)法應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測(cè)和大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查；核酸雜交及酶聯(lián)免疫檢測(cè)因技術(shù)本身的限制，其靈敏度均比較低，漏檢率高。隨著分子生物學(xué)與生物信息學(xué)的快速發(fā)展和有機(jī)結(jié)合，基于核酸擴(kuò)增的技術(shù)發(fā)展迅速，日新月異。如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）是一種檢測(cè)RNA類(lèi)病毒的簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的常規(guī)技術(shù)。但是，基于PCR的技術(shù)是終點(diǎn)法分析，需要反復(fù)升降溫的循環(huán)擴(kuò)增和PCR后的凝膠電泳分析結(jié)果，耗時(shí)較長(zhǎng)，且靈敏度仍有待提高。之后，無(wú)需電泳分析的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR成為更快捷的一種核酸擴(kuò)增和RNA病毒檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)利用熒光探針實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的特異性檢測(cè)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的全過(guò)程從而能實(shí)時(shí)分析檢測(cè)結(jié)果。由于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR仍需要有反轉(zhuǎn)錄步驟和變性、退火及延伸等三個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行幾十次升降溫循環(huán)，每個(gè)溫度點(diǎn)和時(shí)間也需精確設(shè)定，整個(gè)反應(yīng)仍需耗時(shí)2～2.5小時(shí)以上。近年來(lái)，一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)—等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下的檢測(cè)。如DNA環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated?Isothermal?Amplification?of?DNA，LAMP）應(yīng)用的比較廣泛，也有相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)，但LAMP技術(shù)需要使用4條引物，一共識(shí)別靶DNA的6個(gè)不同區(qū)域，雖然提高了特異性，但針對(duì)變異大的病毒核酸分子在設(shè)計(jì)上非常困難。核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增（Nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA）技術(shù)是另一種快速等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它克服了以往核酸擴(kuò)增的不足，更為簡(jiǎn)便高效，尤其適用于RNA病毒的檢測(cè)。與PCR不同，NASBA是在AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7?RNA聚合酶等三種酶的共同協(xié)作下，在41～42℃，由一對(duì)引物指導(dǎo)的連續(xù)均一的體外特異核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增酶促過(guò)程。其中一條引物其5’端具有被T7?RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列。在NASBA基礎(chǔ)上結(jié)合分子信標(biāo)（molecular?beacon）探針可以建立實(shí)時(shí)NASBA（Real-time?NASBA）等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）等溫?cái)U(kuò)增：反應(yīng)在同一恒溫體系條件下進(jìn)行；（2）快速高效、靈敏度高：實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)是一種無(wú)需升降溫的連續(xù)快速擴(kuò)增，也不需RT-PCR反應(yīng)中第一階段15～30分鐘的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，整個(gè)反應(yīng)時(shí)間短、單鏈RNA產(chǎn)物積累迅速，可以在60～90分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，并使模板RNA擴(kuò)增109倍以上，靈敏度甚至可以達(dá)到檢測(cè)拷貝數(shù)為個(gè)位的模板RNA。例如目前針對(duì)A型禽流感病毒所有亞型研發(fā)的NASBA/ECL檢測(cè)試劑盒，其正式發(fā)表的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，NASBA技術(shù)比目前商品化的免疫檢測(cè)試劑盒敏感10～1000倍，比常規(guī)PCR方法也敏感許多；（3）特異性高、實(shí)時(shí)檢測(cè)：反應(yīng)不需高溫變性，即使有雙鏈DNA污染也不會(huì)被擴(kuò)增，而通過(guò)分子信標(biāo)探針的檢測(cè)進(jìn)一步提高了特異性和靈敏度，也實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)檢測(cè)和結(jié)果分析；（4）設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單：它只需設(shè)計(jì)1對(duì)引物和1條探針來(lái)識(shí)別靶RNA的3個(gè)不同區(qū)域，對(duì)于檢測(cè)變異度高的病毒核酸來(lái)說(shuō)，設(shè)計(jì)上相對(duì)LAMP技術(shù)更為容易。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于實(shí)時(shí)NASBA（Real-time?NASBA）技術(shù)的對(duì)星狀病毒具有特異性檢測(cè)作用的引物；本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種基于實(shí)時(shí)NASBA（Real-time?NASBA）技術(shù)的對(duì)星狀病毒基因組具有特異性檢測(cè)作用的分子信標(biāo)探針；此外本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種利用上述引物對(duì)和分子信標(biāo)探針基于實(shí)時(shí)核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增（Real-time?NASBA）技術(shù)檢測(cè)星狀病毒的檢測(cè)試劑盒。本專(zhuān)利技術(shù)一種星狀病毒檢測(cè)用引物所采用的技術(shù)方案是，本專(zhuān)利技術(shù)包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的堿基序列表示如下：正向引物F1：5’-TCARTCTWMTCARCGTGTCCGTA-3’；反向引物R1：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGAGDATRCACGCCTCRATYTC-3’。所述反向引物R1的5’端的25個(gè)堿基是增加的T7噬菌體啟動(dòng)子序列，而3’端23個(gè)堿基是與星狀病毒ORF2互補(bǔ)的特異性序列，所述正向引物F1和所述反向引物R1的3’端的病毒核酸變異位點(diǎn)使用簡(jiǎn)并堿基。本專(zhuān)利技術(shù)一種星狀病毒檢測(cè)用分子信標(biāo)探針?biāo)捎玫募夹g(shù)方案是，所述分子信標(biāo)探針的堿基序列表示如下：分子信標(biāo)探針P1：5’-HEX-CCAAGCAACTCAGGAAACARGGTGTCGCTTGG-DABCYL-3’，所述分子信標(biāo)探針P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)HEX，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)DABCYL，病毒核酸變異位點(diǎn)使用簡(jiǎn)并堿基。本專(zhuān)利技術(shù)一種星狀病毒實(shí)時(shí)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒所采用的技術(shù)方案是，所述試劑盒至少包括2×實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)液和5×酶混合液，所述2×實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)液包含有如上所述的正向引物F1和反向引物R1以及分子本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種星狀病毒檢測(cè)用引物，其特征在于，包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的堿基序列表示如下：正向引物F1：5’？TCARTCTWMTCARCGTGTCCGTA？3’；反向引物R1：5’？AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGAGDATRCACGCCTCRATYTC？3’。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種星狀病毒檢測(cè)用引物，其特征在于，包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的堿基序列表示如下：
正向引物F1：5’-TCARTCTWMTCARCGTGTCCGTA-3’；
反向引物R1：
5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGAGDATRCACGCCTCRATYTC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種星狀病毒檢測(cè)用引物，其特征在于：所述反向引物R1的5’端的25個(gè)堿基是增加的T7噬菌體啟動(dòng)子序列，而3’端23個(gè)堿基是與星狀病毒ORF2互補(bǔ)的特異性序列，所述正向引物F1和所述反向引物R1的3’端的病毒核酸變異位點(diǎn)使用簡(jiǎn)并堿基。
3.一條星狀病毒檢測(cè)用分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針的堿基序列表示如下：
分子信標(biāo)探針P1：
5’-HEX-CCAAGCAACTCAGGAAACARGGTGTCGCTTGG-DABCYL-3’，
所述分子信標(biāo)探針P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)HEX，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)DABCYL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一條星狀病毒檢測(cè)用分子信標(biāo)探針，其特征在于：所述分子信標(biāo)探針P1的5’端和3...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：莫秋華，譚華，李衛(wèi)崗，楊澤，劉志明，林繼燦，杜田，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：珠海國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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