本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種基于實(shí)時(shí)核酸序列依賴性擴(kuò)增（Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）技術(shù)的腸道病原體快速檢測技術(shù)。具體提供了一種A組輪狀病毒實(shí)時(shí)等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒及其一對(duì)引物和一條分子信標(biāo)探針。所述試劑盒包括含有上述引物和探針的2×實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)液、5×酶混合液及陽性對(duì)照模板、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。所述引物和探針序列是序列編號(hào)為SEQIDNO：1～3所示的序列，能特異性擴(kuò)增和檢測A組輪狀病毒VP6基因。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒具有快速、高效、敏感特異和實(shí)時(shí)檢測分析等特點(diǎn)，可應(yīng)用于臨床和口岸的常規(guī)檢測和疾病防控領(lǐng)域。????
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種基于實(shí)時(shí)核酸序列依賴性擴(kuò)增（Nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA）技術(shù)的腸道病原體快速檢測技術(shù)。具體涉及A組輪狀病毒實(shí)時(shí)NASBA等溫?cái)U(kuò)增快速檢測試劑盒；還涉及所述試劑盒中使用的對(duì)于A組輪狀病毒VP6基因具有特異性的引物對(duì)和分子信標(biāo)探針。
技術(shù)介紹
A組輪狀病毒（Rotavirus，RV）是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒重癥腹瀉的最主要病原，占兒科腸道感染病因的50%以上，其基因組由11個(gè)不連續(xù)的雙鏈RNA基因片段組成，其中VP6基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白所存在的抗原性差異是輪狀病毒分組的依據(jù)。A組輪狀病毒也是導(dǎo)致發(fā)展中國家嬰幼兒死亡的主要病因之一，資料顯示，全世界每年約有60萬5歲以下兒童的死亡與A組輪狀病毒感染有關(guān)。因此，一套簡便快速、特異性強(qiáng)的A組輪狀病毒檢測技術(shù)，可以為腹瀉病的防控和臨床診斷提供有力的技術(shù)支持。目前，針對(duì)輪狀病毒的檢測，經(jīng)典的方法有電鏡觀察、病毒分離培養(yǎng)、核酸雜交、酶聯(lián)免疫等。電鏡觀察不但敏感度低、而且價(jià)格昂貴、設(shè)備和技術(shù)條件要求甚高，無法應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測和大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查；病毒分離培養(yǎng)法的缺陷是操作繁瑣，耗時(shí)很長，通常需要一周左右的時(shí)間才能觀察到細(xì)胞病理變化，不適于快速檢測和臨床緊急病情處理；核酸雜交及酶聯(lián)免疫檢測因技術(shù)本身的限制，其靈敏度均比較低，漏檢率高。隨著分子生物學(xué)與生物信息學(xué)的快速發(fā)展和有機(jī)結(jié)合，基于核酸擴(kuò)增的技術(shù)發(fā)展迅速，日新月異。如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）是一種檢測RNA類病毒的簡便、準(zhǔn)確的常規(guī)技術(shù)。但是，基于PCR的技術(shù)是終點(diǎn)法分析，需要反復(fù)升降溫的循環(huán)擴(kuò)增和PCR后的凝膠電泳分析結(jié)果，耗時(shí)較長，且靈敏度仍有待提高。之后，無需電泳分析的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR成為更快捷的一種核酸擴(kuò)增和RNA病毒檢測技術(shù)。該技術(shù)利用熒光探針實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的特異性檢測，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增反應(yīng)的全過程從而能實(shí)時(shí)分析檢測結(jié)果。由于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR仍需要有反轉(zhuǎn)錄步驟和變性、退火及延伸等三個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行幾十次升降溫循環(huán)，每個(gè)溫度點(diǎn)和時(shí)間也需精確設(shè)定，整個(gè)反應(yīng)仍需耗時(shí)2～2.5小時(shí)以上。近年來，一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)—等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下的檢測。如DNA環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated?Isothermal?Amplification?of?DNA，LAMP）應(yīng)用的比較廣泛，也有相關(guān)專利申請(qǐng)，但LAMP技術(shù)需要使用4條引物，一共識(shí)別靶DNA的6個(gè)不同區(qū)域，雖然提高了特異性，但針對(duì)變異大的病毒核酸分子在設(shè)計(jì)上非常困難。核酸序列依賴性擴(kuò)增（Nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA）技術(shù)是另一種快速等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它克服了以往核酸擴(kuò)增的不足，更為簡便高效，尤其適用于RNA病毒的檢測。與PCR不同，NASBA是在AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7?RNA聚合酶等三種酶的共同協(xié)作下，在41～42℃，由一對(duì)引物指導(dǎo)的連續(xù)均一的體外特異核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增酶促過程。其中一條引物其5’端具有被T7?RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列。在NASBA基礎(chǔ)上結(jié)合分子信標(biāo)（molecular?beacon）探針可以建立實(shí)時(shí)NASBA（Real-time?NASBA）等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）等溫?cái)U(kuò)增：反應(yīng)在同一恒溫體系條件下進(jìn)行；（2）快速高效、靈敏度高：實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)是一種無需升降溫的連續(xù)快速擴(kuò)增，也不需RT-PCR反應(yīng)中第一階段15～30分鐘的反轉(zhuǎn)錄過程，整個(gè)反應(yīng)時(shí)間短、單鏈RNA產(chǎn)物積累迅速，可以在60～90分鐘內(nèi)完成檢測，并使模板RNA擴(kuò)增109倍以上，靈敏度甚至可以達(dá)到檢測拷貝數(shù)為個(gè)位的模板RNA。例如目前針對(duì)A型禽流感病毒所有亞型研發(fā)的NASBA/ECL檢測試劑盒，其正式發(fā)表的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，NASBA技術(shù)比目前商品化的免疫檢測試劑盒敏感10～1000倍，比常規(guī)PCR方法也敏感許多；（3）特異性高、實(shí)時(shí)檢測：反應(yīng)不需高溫變性，即使有雙鏈DNA污染也不會(huì)被擴(kuò)增，而通過分子信標(biāo)探針的檢測進(jìn)一步提高了特異性和靈敏度，也實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)檢測和結(jié)果分析；（4）設(shè)計(jì)簡單：它只需設(shè)計(jì)1對(duì)引物和1條探針來識(shí)別靶RNA的3個(gè)不同區(qū)域，對(duì)于檢測變異度高的病毒核酸來說，設(shè)計(jì)上相對(duì)LAMP技術(shù)更為容易。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于實(shí)時(shí)NASBA（Real-time?NASBA）技術(shù)的對(duì)A組輪狀病毒VP6基因具有特異性檢測作用的引物；本專利技術(shù)還提供了一種基于實(shí)時(shí)NASBA（Real-time?NASBA）技術(shù)的對(duì)A組輪狀病毒VP6基因具有特異性檢測作用的分子信標(biāo)探針；此外本專利技術(shù)還提供了一種利用上述引物對(duì)和分子信標(biāo)探針基于實(shí)時(shí)核酸序列依賴性擴(kuò)增（Real-time?NASBA）技術(shù)檢測A組輪狀病毒的檢測試劑盒。本專利技術(shù)一種A組輪狀病毒檢測用引物所采用的技術(shù)方案是，本專利技術(shù)包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的堿基序列表示如下：正向引物F1：5’-AACATCATGCWACRGTWGGACT-3’；反向引物R1：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGATGGTTAGYYTGGTCCTYA-3’。所述反向引物R1的5’端的25個(gè)堿基是增加的T7噬菌體啟動(dòng)子序列，而3’端22個(gè)堿基是與A組輪狀病毒VP6基因靶RNA互補(bǔ)的特異性序列，所述正向引物F1和所述反向引物R1的3’端的病毒核酸變異位點(diǎn)使用簡并堿基。本專利技術(shù)一種A組輪狀病毒檢測用分子信標(biāo)探針?biāo)捎玫募夹g(shù)方案是，所述分子信標(biāo)探針的堿基序列表示如下：分子信標(biāo)探針P1：5’-FAM-CGATCGTATGCNRTACCRGTTGGACCCGATCG-DABCYL-3’，所述分子信標(biāo)探針P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)DABCYL，病毒核酸變異位點(diǎn)使用簡并堿基。本專利技術(shù)一種A組輪狀病毒檢測用試劑盒所采用的技術(shù)方案是，所述試劑盒至少包括2×實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)液和5×酶混合液，所述2×實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)液包含有如上所述的正向引物F1和反向引物R1以及分子信標(biāo)探針P1。所述2×實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)液包括如表1所示的組分：??????????????????表1??2×實(shí)時(shí)NASBA反應(yīng)液??????????????????表2??5×酶混合液所述5×酶混合液包括如下組分：所述試劑盒還包括陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。所述陽性對(duì)照為A組輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的VP6基因RNA片段。所述陰性對(duì)照為在核酸提取時(shí)與標(biāo)本同時(shí)平行提取無菌生理鹽水。所述空白對(duì)照為無核酸酶的超純水。本專利技術(shù)的有益效果是：本專利技術(shù)通過提供一種對(duì)A組輪狀病毒VP6基因具有特異性的一對(duì)引物和一條分子信標(biāo)探針，及包含上述引物對(duì)和分子信標(biāo)探針的試劑盒，來檢測離體標(biāo)本中是否存在A組輪狀病毒VP6基因，進(jìn)而確定離體標(biāo)本中是否存在A組輪狀病毒。本專利技術(shù)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種A組輪狀病毒檢測用引物，其特征在于，包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的堿基序列表示如下：正向引物F1：5’？AACATCATGCWACRGTWGGACT？3’；反向引物R1：？5’？AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGATGGTTAGYYTGGTCCTYA？3’。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種A組輪狀病毒檢測用引物，其特征在于，包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的堿基序列表示如下：
正向引物F1：5’-AACATCATGCWACRGTWGGACT-3’；
反向引物R1：?
5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGATGGTTAGYYTGGTCCTYA-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種A組輪狀病毒檢測用引物，其特征在于：所述反向引物R1的5’端的25個(gè)堿基是增加的T7噬菌體啟動(dòng)子序列，而3’端22個(gè)堿基是與A組輪狀病毒VP6基因靶RNA互補(bǔ)的特異性序列，所述正向引物F1和所述反向引物R1的3’端的病毒核酸變異位點(diǎn)使用簡并堿基。
3.一條A組輪狀病毒檢測用分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針的堿基序列表示如下：
分子信標(biāo)探針P1：
5’-FAM-CGATCGTATGCNRTACCRGTTGGACCCGATCG-DABCYL-3’，
所述分子信標(biāo)探針P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)DABCYL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一條A組輪狀病毒檢測用分子信標(biāo)探針，其特征在于：所述分子信標(biāo)探針P1的5’端和3’端...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：莫秋華，伍碧梅，趙俊華，楊澤，譚華，林繼燦，杜田，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：珠海國際旅行衛(wèi)生保健中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。