本發明專利技術公開了一種可用于檢測SRBSDV的引物以及試劑盒，還公開了一種利用該試劑盒定量檢測SRBSDV的方法，首先合成前述的引物；然后利用RNA提取試劑盒從樣品中提取其RNA；以RNA為模板并利用cDNA合成反應體系合成cDNA，再制備陽性標準樣品，該陽性標準樣品經實時熒光定量PCR反應程序繪制得到熒光信號達到閾值的循環數-起始濃度對數值的標準曲線；最后以合成的cDNA為模板配制實時熒光定量RT-PCR反應體系，通過實時熒光定量RT-PCR反應程序進行擴增反應，根據采集的熒光信號和標準曲線測得樣品中SRBSDV的起始濃度值。本發明專利技術的方法具有精確度高、穩定性好、重復性好、特異性強、靈敏度高等優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物病毒分子生物學檢測和鑒定
，尤其涉及ー種植物病毒檢測用引物、試劑盒及檢測方法。
技術介紹
南方水稻黑條矮縮病毒(Southernrice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)是今年來嚴重危害水稻的ー種新病毒。2009年以來，在我國南方主要水稻種植區爆發成災，僅2010年，南方水稻黑條矮縮病毒病發生面積就達到1400多萬畝，嚴重威脅到我國水稻的安全生產。 南方水稻黑條矮縮病毒(Southernrice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fi jivirus),病毒粒體球狀,基因組由10條雙鏈RNA(dsRNA)組成，由白背飛風(Sogatella furcifera Horvath)以持久性方式傳播。侵染水稻癥狀表現為植株矮縮、葉色深緑、高位分蘗、莖桿出現乳白色或淺褐色點條狀突起，莖節上出現氣生須根。SRBSDV主要浸染禾本科作物和雜草，如水稻、高粱和玉米以及看麥娘等，病害發生嚴重時能導致作物絕收。由于SRBSDV是近年來水稻上分離并命名的ー種新病毒病，目前，檢測的方法主要是病害癥狀鑒別、血清學技術和常規RT-PCR技術。病害癥狀鑒別主要根據SRBSDV浸染水稻的典型癥狀來鑒別，但在SRBSDV浸染水稻早期，水稻不會表現典型癥狀，因此，如果單憑病害癥狀鑒定該病害，則SRBSDV造成的損失可能已無法避免。血清學技術主要依據SRBSDV編碼的蛋白作為抗原，與抗體在體外一定條件下作用，可出現肉眼可見的沉淀、凝集現象。而常規RT-PCR技術則通過將目的DNA片段擴增至數十萬倍乃至百萬倍，直至肉眼能夠直接判斷。然而，現有的技術均不能定量地檢測SRBSDV病毒含量。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供ー種可用于檢測南方水稻黑條矮縮病毒的引物和試劑盒，還提供一種精確度高、穩定性好、重復性好、特異性強、靈敏度高的定量檢測南方水稻黑條矮縮病毒的方法。為解決上述技術問題，本專利技術提出的技術方案為ー種可用于檢測南方水稻黑條矮縮病毒的引物，所述引物由上游引物和下游引物組成，所述上游引物和下游引物的序列如下所示上游引物CTTTGACCGAGATGAGC；下游引物ACCTTCGTGAATGATGIT。作為ー個總的技術構思，本專利技術還提供ー種可用于檢測南方水稻黑條矮縮病毒的試劑盒，包括以下組成試劑包含上述引物的引物溶液；陽性標準樣品；RNA提取試劑盒；cDNA合成反應體系；和實時熒光定量RT-PCR反應體系。作為ー個總的技術構思，本專利技術還提供ー種定量檢測南方水稻黑條矮縮病毒的方法，包括以下步驟(I)合成上述的引物；(2)利用RNA提取試劑盒從待測農作物樣品中提取其RNA ;所述農作物包括水稻、 高粱、玉米、看麥娘等；(3)以步驟(2)中提取的RNA為模板，利用cDNA合成反應體系合成cDNA ；(4)制備陽性標準樣品，該陽性標準樣品經實時熒光定量PCR反應程序繪制得到熒光信號達到閾值的循環數-起始濃度對數值的標準曲線；(5)以步驟(3)中合成的cDNA為模板，添加熒光染料和步驟(I)中合成的引物配制實時熒光定量RT-PCR反應體系，通過實時熒光定量RT-PCR反應程序進行擴增反應，在每個反應循環的延伸溫度步驟采集熒光信號(采集的信號值，通過信號值可以確定對應的循環數)，最后根據步驟(4)中建立的熒光信號達到閾值的循環數-起始濃度對數值的標準曲線，測得待測農作物樣品中南方水稻黑條矮縮病毒的起始濃度值。上述方法的步驟(3)中，合成cDNA的具體方法優選包括以下步驟將RNA free水、隨機引物六聚體和所述提取的RNA混勻，置于變性溫度65°C，4min 6min ;取出置于冰上，然后加入M-MLV反轉錄酶、M-MLV Buffer, dNTP Mixture和RNA抑制劑，進行RT反應合成cDNA。上述方法的步驟(4)中，陽性標準樣品的制備方法優選具體包括以下步驟從水稻陽性樣品中提取南方水稻黑條矮縮病毒的RNA，然后以該RNA為模板，采用cDNA合成反應體系進行RT反應，得到其cDNA ；以該cDNA為模板進行PCR擴增反應，對擴增反應產物進行回收純化，再進行連接和轉化E. coli感受態DH5 a，得到陽性克隆菌液；將陽性克隆菌液接種于培養基中培養，再從中提取病毒質粒，采用紫外分光光度法測定出病毒質粒含量，最后將病毒質粒用超純水梯度稀釋，得到一組陽性標準樣品。上述的檢測方法中，所述RT反應的程序優選包括30°C，Ih ；70°C,15min ;_4°C保存。上述的檢測方法中，所述PCR擴增反應的程序優選包括95°C預變性5min ；35個循環95°C變性50s，58°C退火50s，72°C延伸2min ;最后72°C延伸lOmin，_4°C保存。上述的檢測方法中，所述熒光信號達到閾值的循環數-起始濃度對數值的標準曲線的擬合方程優選為Y = -3. 901X+6. 068，其中，Y表示熒光信號達到閾值的循環次數，X表示起始濃度值(単位為拷貝/UL)，檢測下限150拷貝/UL，線性檢測范圍為150 25703957. 83 拷貝 /u L0上述的檢測方法中，所述實時熒光定量RT-PCR反應程序優選包括UDG孵育50°C，2min ;變性溫度95°C，10min ;35個反應循環變性溫度95°C，15s ;退火溫度58°C，30s ;延伸溫度 72°C, 30so上述本專利技術的技術方案主要基于以下原理本專利技術的實時突光定量RT-PCR反應技術是在實時熒光定量RT-PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過已經建立的標準曲線對待測樣品中的南方水稻黑條矮縮病毒進行定量分析。與現有技術相比，本專利技術的優點在于I.本專利技術的方法穩定性好、靈敏度高、精度高、特異性強；2.本專利技術方法的檢測時間短，從樣品總RNA的抽提到得到檢測結果，僅需要3. 5h ；3.本專利技術的方法既可以定量檢測、又能定性檢測南方水稻黑條矮縮病毒，對減輕南方水稻黑條矮縮病毒對農作物危害，減少農作物損失具有重要意義。附圖說明·圖I為本專利技術實施例中引物特異性考察的電泳圖，其中譜帶1、2表示RBSDV陽性樣品RT-PCR擴增檢測結果；譜帶3、4表示SRBSDV陽性樣品RT-PCR擴增檢測結果；CK為滅菌超純水對照；M為DL2000Marker。圖2為本專利技術實施例I中得到的熒光信號值與采集信號循環數的標準擴增曲線。圖3為本專利技術實施例I中得到的熒光信號達到閾值的循環數-起始濃度對數值的標準曲線。具體實施例方式以下結合說明書附圖和具體優選的實施例對本專利技術作進ー步描述，但并不因此而限制本專利技術的保護范圍。實施例I :—種本專利技術的可用于檢測南方水稻黑條矮縮病毒的引物，該引物由上游引物和下游引物組成，上游引物和下游引物的序列如下表I所示，上游引物的序列如表I中的SEQ ID1，下游引物的序列如表I中的SEQ ID 2。表I :本實施例的引物序列表編號序列(5’-3つ位SSEQ ID I CTTTG AC'CGAG AIG AGC1608 i 624 S EQ ID 2 AC C TTC G rG A本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種可用于檢測南方水稻黑條矮縮病毒的引物，所述引物由上游引物和下游引物組成，所述上游引物和下游引物的序列如下所示：上游引物：CTTTGACCGAGATGAGC；下游引物：ACCTTCGTGAATGATGTT。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張松柏，劉勇，張德詠，羅香文，程菊娥，彭靜，譚新球，成飛雪，朱春暉，楊春曉，
申請(專利權)人：湖南省植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：
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