一種檢測甲型流感病毒的環介導等溫擴增通用試劑盒及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種檢測甲型流感病毒的環介導等溫擴增通用試劑盒及其應用。本發明專利技術提供的專用引物，包括引物1、引物2、引物3，引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4。本發明專利技術的實驗證明，本發明專利技術的專用引物適用于對甲型流感病毒進行特異性檢測。本發明專利技術的優點：(1)只需在恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊設備；(2)特異性高；(3)快速高效，擴增反應在35分鐘內即可完成；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡單。本發明專利技術特別適用于基層醫療單位臨床標本的快速檢測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，尤其涉及一種檢測甲型流感病毒的環介導等溫擴增通用試劑盒及其應用。
技術介紹
流感病毒屬于正黏病毒科，分甲、乙、丙三種型別，甲型和乙型流感對人類威脅較大，其中甲型流感抗原變異頻繁，可引起世界性大流行，對人類威脅最大。這類病毒所致疾病的臨床表現為起病急、高熱、肌痛、頭痛伴有嚴重不適、干咳、咽喉痛，嚴重時可能導致人死亡，嚴重威脅人類健康。尤其是流感大流行傳播迅速，波及范圍廣，發病率和死亡率高，嚴重威脅著人類健康。1918年的HlNl “西班牙流感”、1957年H2N2 “亞洲流感”和1968年H3N2 “香港流感”三次流感大流行導致全球超過5千萬人死亡。最近暴發的2009年HlNl流感大流行，全球估計有數億人感染，至少I萬2千余人死亡。流感病毒檢測方法的臨床意義在很大程度上取決于方法的快速性。對于流感病毒早期快速診斷對于流感流行的防控亦起著至關重要的作用。目前臨床應用的流感病毒的檢測方法有免疫熒光法、酶免疫測定法、免疫色譜法、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和實時熒光定量PCR技術等。這些方法或者需時較長，或者需要特殊的儀器，難以廣泛應用。免疫層析法是近年來發展的一種快速診斷技術，該技術應用免疫膠體金或免疫酶染色可使特定區域顯示一定的顏色，從而實現特異性的快速免疫診斷，但靈敏度不高。環介導等溫擴增法(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)法具有在等溫條件下即可高速、快速、高特異、高靈敏的擴增靶序列的特點。該方法利用4條特異引物在高活性鏈置換DNA聚合酶作用下，不斷大量復制擴增核酸。核酸大量合成時，dNTP會析出大量的焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與LAMP體系中的Mg2+(或Mn2+)結合，產生焦磷酸鎂或焦磷酸錳沉淀，從而引起反應液的濁度變化，非常易于判斷。此外，利用一些熒光燃料，如SYBR green I染料或者與鈣黃綠素指示LAMP反應。SYBRgreen I染料可與雙鏈DNA產物結合，當有產物大量擴增時，反應體系呈現顯著的熒光信號變化。鈣黃綠素在反應初始時與Mn2+結合，反應液顯示透明的橙色，當有核酸產物大量合成時，會生成副產物焦磷酸根，使Mg2+游離出來，與鈣黃綠素結合，最終使反應液顯示微濁的黃綠色。由于LAMP方法試驗要求條件低，結果易于判斷，非常適宜缺少儀器設備的基層單位或者現場進行流感病毒的篩查。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種檢測甲型流感病毒的專用引物。本專利技術提供的專用引物，包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。所述專用引物還包括引物5，所述引物5的核苷酸序列為序列表的序列5。所述專用引物由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5組成；所述甲型流感病毒具體為甲型流感病毒HlNl亞型A/Beijing/501/2009株。所述專用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LB的5’端和/或3’端還可根據靶序列進行延長；所述專用引物中，F3、B3、FIP、BIP、LB還可進行堿基的替換和/或取代，保持3’末端序列6個堿基100%的同源性即可。FIP和BIP中TTTT(下劃線者)為連接序列，其長度一般為4個，數目可相應縮短和延長。本專利技術的第二個目的是提供一種檢測甲型流感病毒的環介導等溫擴 增(LAMP)試劑。本專利技術提供的試劑，包括RNA逆轉錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環介導等溫擴增緩沖液、所述的專用引物。所述擴增試劑還包括鈣黃綠素；所述擴增試劑由RNA逆轉錄酶、Bst DNA聚合酶、2X環介導等溫擴增緩沖液、所述的專用引物和鈣黃綠素組成；所述的專用引物中的引物I和引物2在對應的所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度均為5pmol/L ;所述的專用引物中的引物3和引物4在對應的所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度均為40pmol/L ;所述的專用引物中的引物5在對應的所述環介導等溫擴增試劑中的終濃度均為20pmol/L ；所述的引物5可與莖環結構結合啟動鏈置換合成，提高擴增效率。擴增的最后產物是具有不同個數的莖環結構、不同長度DNA的混合物，其產量可達10 yg以上，是普通PCR反應DNA產率的至少50倍。所述RNA逆轉錄酶在所述環介導等溫擴增試劑中的濃度為O. 004U/ μ L ；所述RNA逆轉錄酶具體為AMV逆轉錄酶；所述Bst DNA聚合酶在所述環介導等溫擴增試劑中的濃度為O. 32U/ μ L ；所述鈣黃綠素在所述環介導等溫擴增試劑中的濃度為50 μ mol/L ；所述2X環介導等溫擴增緩沖液按照如下方法制備將氯化鉀(KCl)、硫酸鎂(MgSO4)、硫酸銨((NH4)2SO4)、吐溫 20 (Tween-20)、甜菜堿(Betaine)、氯化錳(MnCl2)和dNTPs (脫氧核苷三磷酸混合物dATP、dCTP、dGTP和dTTP)溶于濃度為40mmol/L、PH值為8. 8的Tris鹽酸鹽緩沖液得到；在所述2 X環介導等溫擴增緩沖液中，所述氯化鉀的濃度為20mmol/L，所述硫酸鎂的濃度為16mmol/L，所述硫酸銨的濃度為20mmol/L，所述吐溫20的濃度為O. 2% (質量百分含量)，所述甜菜堿的濃度為I. 6mol/L，所述氯化錳的濃度為lmmol/L，每種所述dNTP的濃度均為2. 8mmol/L0所述甲型流感病毒具體為甲型流感病毒HlNl亞型A/Beijing/501/2009株。本專利技術的第三個目的是提供一種檢測甲型流感病毒的試劑盒。本專利技術提供的試劑盒，包括所述的環介導等溫擴增試劑；所述甲型流感病毒具體為甲型流感病毒HlNl亞型A/Beijing/501/2009株。所述專用引物或所述的環介導等溫擴增試劑在制備用于鑒定和/或輔助鑒定甲型流感病毒的試劑盒中的應用也是本專利技術保護的范圍；或所述專用引物或所述的環介導等溫擴增試劑或所述的試劑盒在鑒定和/或輔助鑒定甲型流感病毒中的應用也是本專利技術保護的范圍。所述甲型流感病毒具體為甲型流感病毒HlNl亞型A/Beijing/501/2009株。本專利技術的第四個目的是提供一種鑒定和/或輔助鑒定待測樣品中甲型流感病毒的方法。本專利技術提供的方法，包括如下步驟用所述專用引物或所述的環介導等溫擴增試劑或所述的試劑盒中的所述專用引物對待測樣品進行環介導等溫擴增，檢測環介導等溫擴增反應產物； 所述環介導等溫擴增中，以待測樣品的RNA為模板；所述環介導等溫擴增反應條件為先60°C _65°C反應35-60min，然后75°C 2min終止反應。所述環介導等溫擴增反應條件為先63°C反應35min，然后75°C 2min終止反應；所述待測樣本為咽拭子或含漱液。本專利技術的檢測對象不局限于咽拭子或含漱液，還可涉及動物或人的血清、尸解臟器組織等。所述甲型流感病毒具體為甲型流感病毒HlNl亞型A/Beijing/501/2009株。所述檢測環介導等溫擴增反應產物的方法為如下I)-3)中的至少一種I)觀察所述環介導等溫擴增反應產物，若所述產物在自然光下為黃綠色，且在紫外光下有熒光(黃綠色熒光)，則待測樣本中含有或者候選含有甲型流感病毒；若所述產物在自然光下為橙黃色，且在紫本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測甲型流感病毒的通用引物，包括引物1、引物2、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：姜濤，劉娟，于學東，秦鄂德，秦成峰，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所，
類型：發明
國別省市：