檢測黃熱病毒的試劑及檢測黃熱病毒的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種檢測黃熱病毒的試劑，它包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP；引物基因序列如下：外引物F3，TGGGAGAGGAGATTCACGT；外引物B3，TCAAGCCGCCAAATAGCC；內(nèi)引物FIP，CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG；內(nèi)引物BIP，AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG。本發(fā)明專利技術(shù)的引物與其它物種的核酸序列無同源，保證了檢測方法的特異性。利用上述引物建立的恒溫?cái)U(kuò)增檢測黃熱病毒的方法具有操作簡便，高效、快速、特異的優(yōu)點(diǎn)；該方法的建立，填補(bǔ)了黃熱病毒恒溫核酸擴(kuò)增檢測方法的空白，對樣本的檢測只需1小時(shí)左右即可完成，對防止國境口岸防御黃熱病毒的傳入具有重要意義。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及檢測黃熱病毒的試劑及黃熱病毒的檢測方法，尤其涉及利用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測黃熱病毒的方法。
技術(shù)介紹
黃熱病毒(Yellow fever virus, YF)屬于黃病韋科(Flaviridae)黃病韋屬(Flavivirus)成員，是引起人類黃熱病的病原體，該病主要流行于非洲及南美洲，經(jīng)蚊傳播的急性傳染病，屬于國際檢疫、監(jiān)控的3種傳染病之一。人對該病毒普遍敏感,不分年齡、性別和種族。黃熱病一般呈散發(fā)，如果媒介蚊蟲大量繁殖，感染能在人群中引起流行，在某些暴發(fā)疫情中病死率可高達(dá)20% -40%，危害極大。WHO原希望到2015年能在全球徹底消滅黃熱病，但根據(jù)2009年的估計(jì)材料，全球每年仍可出現(xiàn)20. 6萬病例，其中四分之一病例死 亡。隨著我國改革開放以及對外交流的增多，特別是我省對外貿(mào)易的不斷増加，不能排除該病毒隨外來人員或媒介傳人我國的可能，所以，黃熱病毒的檢疫需要快速敏感的檢測手段。一般來說，用動物或細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒最為可靠，但費(fèi)吋，費(fèi)力，常用的血清學(xué)方法對少量病毒抗原的檢測敏感度不夠高。這些方法已經(jīng)愈來愈跟不上人類對致病微生物快速、簡易、高特異性的鑒定要求。由于核酸檢測技術(shù)具有快速、靈敏等優(yōu)勢，已經(jīng)成為了目前病原檢測最常用的方法之一。特別是PCR技木，能對微量樣本進(jìn)行快速擴(kuò)增，但由于PCR反應(yīng)分為解鏈、退火和延伸三個(gè)階段而且只有延伸階段進(jìn)行DNA擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率和速度受到很大影響，而且特異性、操作的簡易性都存在不足之處，特別是對試劑、昂貴儀器的嚴(yán)格要求和必須專業(yè)人員操作等因素，大大地限制了其在基層單位和現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)依賴于 4 條能夠識別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和ー種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，不需要熱變性的DNA作為模板，在恒溫下就可進(jìn)行高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。因此該方法具有很高的推廣應(yīng)用價(jià)值，不僅適合于科研工作，還可以作為設(shè)備條件相對較差的基層單位相關(guān)人員進(jìn)行常規(guī)和應(yīng)急檢測的工具。除了進(jìn)行DNA檢測之外，在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶后，還可以通過RT-LAMP (逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增)方法從模板RNA開始進(jìn)行檢測。逆轉(zhuǎn)錄和等溫?cái)U(kuò)增在相同溫度下一歩完成，很大程度上提高了檢測的靈敏度并節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的第一個(gè)目的在于提供ー種檢測黃熱病毒的試劑，可以用于快速準(zhǔn)確地檢測黃熱病毒，從而能夠建立適于ロ岸衛(wèi)生檢疫的黃熱病毒檢測方法。為此，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案它包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP;引物基因序列如下外引物F3: TGGGAGAGGAGATTCACGT ；外引物B3: TCAAGCCGCCAAATAGCC ；內(nèi)引物FIP:CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG ；內(nèi)引物BIP:AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG。本專利技術(shù)另ー個(gè)目的是提供ー種恒溫?cái)U(kuò)增檢測黃熱病毒的方法，可以快速準(zhǔn)確地檢測黃熱病毒。為此，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案所述方法的反應(yīng)體系為25 U I :20mmol/l Tris-HCl, 10mmo I /1 KCl, 10mmo I /l(NH4)2S04,8mmol/l MgSO4,0. I % Tween-20，外引物與內(nèi)引物濃度比例為1: 8，外引物F3與B3 均為 5pmol/l，內(nèi)引物 BIP 與 FIP 40pmol/l，0. 8mol/l 甜菜堿，dNTP I. 4mmol/l, IOUAMV逆轉(zhuǎn)錄酶，8U Bst-DNA聚合酶，5 u IRNA模板，補(bǔ)足DEPC-H2O至25 yl。反應(yīng)溫度選擇63°C。所述方法的步驟為將陰性對照、陽性對照和待測樣本分別按上述反應(yīng)體系孵育630C I小時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，其中陰性對照采用雙蒸水，陽性對照采用黃熱病毒疫苗株；反應(yīng)結(jié)束·后，進(jìn)行以下三種試驗(yàn)中的至少ー種I)、取擴(kuò)增產(chǎn)物觀察電泳結(jié)果，陽性對照孔產(chǎn)生階梯狀的條帶，陰性對照孔則沒有條帶產(chǎn)生，檢測樣本孔中如產(chǎn)生階梯狀條帶則含有黃熱病毒，反之沒有黃熱病毒；2)、反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)管離心6000rpm，3分鐘，觀察結(jié)果，陽性對照管可見白色沉淀，陰性對照管沒有產(chǎn)生沉淀，樣本管中如產(chǎn)生白色沉淀則含有黃熱病毒，反之沒有黃熱病毒；3)、在反應(yīng)體系中加入I. 25 ill熒光染料SYBR Green I，紫外燈下觀察熒光強(qiáng)度的變化，陽性對照產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色熒光，陰性對照熒光強(qiáng)度沒有變化，樣本管中如產(chǎn)生強(qiáng)烈綠色突光則含有黃熱病毒，反之沒有黃熱病毒。本專利技術(shù)從GenBank下載黃熱病毒序列,共選擇33株1940年 2010年黃熱病毒以及疫苗株黃熱病毒的E基因序列，用DNAStar軟件對黃熱病毒E基因序列進(jìn)行比對，根據(jù)目標(biāo)基因中的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)處上述4條引物，引物與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索，和其它物種的核酸序列無同源，保證了檢測方法的特異性。利用上述引物建立的恒溫?cái)U(kuò)增檢測黃熱病毒的方法具有操作簡便，高效、快速、特異的優(yōu)點(diǎn)；該方法的建立，填補(bǔ)了黃熱病毒恒溫核酸擴(kuò)增檢測方法的空白，對樣本的檢測只需I小時(shí)左右即可完成，對防止國境ロ岸防御黃熱病毒的傳入具有重要意義。附圖說明圖I為黃熱病毒等溫?cái)U(kuò)增的特異性試驗(yàn)結(jié)果，M為marker，I為陰性對照，2為陽性對照，3為黃熱疫苗株，4為こ腦病毒，5為登革熱病毒。圖2為黃熱病毒不同溫度條件等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果，I為63°C，2為61. 2°C、3為64. 90C >4 為 59. 40C >5 為 66. 2°C、6 為 58. 0°C、7 為 57. 1°C。圖3為黃熱病毒等溫?cái)U(kuò)增的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果，I為marker，2為6. 6ng，3為6.6X10 :ng, 4 為 6.6X10 2ng, 5 為 6.6X10 3ng, 6 為 6.6X10 4ng, 7 為 6.6X10 5ng, 8 為6. 6 X 10 6ng。具體實(shí)施例方式實(shí)施例I黃熱病毒的檢測I.引物設(shè)計(jì)從GenBank下載代表性的黃熱病毒序列,共選擇33株1940年 2010年黃熱病毒以及疫苗株黃熱病毒的E基因序列，用DNAStar軟件對黃熱病毒E基因序列進(jìn)行比對，根據(jù)目標(biāo)基因中的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，設(shè)計(jì)ー套引物(F3，B3，F(xiàn)IP，BIP)，分別是外引物B3、外引物F3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP。引物基因序列如下外引物F3: TGGGAGAGGAGATTCACGT ；外引物B3: TCAAGCCGCCAAATAGCC ； 內(nèi)引物FIP:CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG ；內(nèi)引物BIP:AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG。2.病毒RNA的提取將黃熱病毒減毒活疫苗按照說明書要求用生理鹽水溶解，吸取200 Ul按試劑盒說明書用Roche試劑盒High Pure Viral Nucleic Acid Kit提取病毒RNA,溶于100 u I無RNase水中，一 70°C保存。3. RT-LAMP的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件RT-LAMP 本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種等溫?cái)U(kuò)增檢測黃熱病毒的試劑，其特征在于：它包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP；引物基因序列如下：外引物F3:TGGGAGAGGAGATTCACGT；外引物B3:TCAAGCCGCCAAATAGCC；內(nèi)引物FIP:CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG；內(nèi)引物BIP:AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：呂沁風(fēng)，鄭偉，吳忠華，曹箏，何蕾，羅鵬，
申請(專利權(quán))人：浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心，
類型：發(fā)明
國別省市：