本發明專利技術提供了一種等溫擴增檢測猴痘病毒的試劑。它包括：（1）檢測猴痘病毒的標準品，所述標準品為采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI質粒，得到的重組質粒載體；所述基因片段的堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示；（2）引物，包括外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP。本發明專利技術還提供了一種等溫擴增檢測猴痘病毒的方法，其利用上述試劑，可以快速準確地檢測猴痘病毒。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及檢測猴痘病毒的試劑及方法，尤其涉及利用等溫擴增技術檢測猴痘病毒的試劑和方法。
技術介紹
猴痘病毒是一種人畜共患病，多發于中非和西非，1958年首次發現于猴子體內，上世紀70年代首次發現于人類感染猴痘病毒，2003年曾在美國威斯康辛州爆發，造成82人感染。猴痘病毒為雙鏈DNA病毒，與天花病毒同屬痘病毒科，感染的癥狀與天花相似，如發熱、頭痛、淋巴結腫大、咳嗽和全身極度疼痛，俗稱“猴天花”，為未輸入我國的危險病毒之一，可通過直接接觸患者或者被感染的動物，或通過患者的體液傳播，毒力強的病毒株有可能致死。天花疫苗對猴痘病毒有一定的抵抗能力，目前30歲以下人群均未接種天花疫苗，一旦 猴痘病毒傳入將造成極大的危害。因此建立快速的猴痘病毒檢測方法具有重要的現實意義。環介導等溫擴增技術是一種高效、特異且不需要特殊儀器的核酸檢測手段，針對靶基因的6個特征區域設計4種引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效擴增。它的產物是由多重復靶序列的莖-環狀DNA和花椰菜狀DNA所組成的混合物，在瓊脂糖凝膠電泳上會呈現出LAMP所特有的階梯狀條帶。LAMP反應過程將產生大量的焦磷酸根離子，與鎂離子結合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，可根據快速離心或者濁度變化，直觀觀察檢測結果，在基層或者落后地區技術人員只需簡單培訓就可完成實驗操作。
技術實現思路
本專利技術首先所要解決的技術問題是提供一種等溫擴增檢測猴痘病毒的試劑，可以用于快速準確地檢測猴痘病毒。為此，本專利技術采用以下技術方案它包括(I)檢測猴痘病毒的標準品，所述標準品為采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI質粒，得到的重組質粒載體；所述基因片段的堿基序列為CCTCTCTCATTGATTTTTCGCGGGATACATCATCTATTATAGCATCAGCATCAGAATCTGTAGGCCGTGTATCAGCATCCATTGTCGTAGACCAACGAGGAGGAGTATCGTCGGAACTGTACACCATAGTACTACGTTGAAGATCATACAGAGCTTTATTAACTTCTCGCTTCTCCATATTAAGTTGTTTAGTTAGTTGTGCAGTAGCTCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGCACACAATCTCTGTGTCAGAACGCTCGTCAATATAGATCGTAGAAATTTTTTAGAGAGAACTAACACAACTAGCAATAAAACTGATCTTATTTTATCATTTTTTTATTCATCATCCTCTGGTGGTTCGTCGTTCCTATCGAATGTAGCTCTGATTAACCCGTCATCTATAGGTGATGCTGGTTCTGGAGATTCTGGAGGAGATGGATTATTAT，如序列表 SEQ NO: I 所示；(2)引物,其基因喊基序列外引物F3:5' -CATTGATTTTTCGCGGGATA-3'；外引物B3:5' -TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3'；內引物FIP :5' -GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3/ ；內引物BIP :5' -TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3/ 。本專利技術另一個所要解決的技術問題是提供一種等溫擴增檢測猴痘病毒的方法，可以快速準確地檢測猴痘病毒。為此，本專利技術采用以下技術方案 它的反應體系25 μ 1，包括10Xbuffer2. 5μ 1，引物混合物I μ 1，模板DNAl μ 1，8U BstDNA 聚合酶 O. 8μ 1，甜菜堿(8Μ) 2μ 1，dNTP(10mM)2y 1，MgSO4(IOOmM) I. 2μ I,I.25 μ I熒光染料20 X Eva Green，加入ddH20補足25 μ I ;反應體系中引物終濃度分別如下外引物F3和外引物Β3各40ρΜ,內引物FIP和內引物BIP各800ρΜ ；將上述反應體系在水浴箱上63 °C 90分鐘，或者在熒光定量PCR儀上63 °C I分鐘，90個循環，同時進行待測樣本、陰性對照和陽性對照的擴增，其中陰性對照采用雙蒸水，陽性對照采用權利要求I所述的檢測猴痘病毒的標準品；反應結束后，取擴增產物觀察電泳結果，陽性對照孔產生階梯狀的條帶，陰性對照孔則沒有條帶產生，待測樣本孔中如產生階梯狀條帶則含有猴痘病毒，反之沒有猴痘病毒；或者，反應結束后，反應管離心6000rpm，3分鐘，觀察結果，陽性對照管可見白色沉淀，陰性對照管沒有產生沉淀，樣本管中如產生白色沉淀則含有猴痘病毒，反之沒有猴痘病毒；或者紫外燈下觀察熒光強度的變化，陽性對照產生強烈綠色熒光，陰性對照熒光強度沒有變化，樣本管中如產生強烈綠色熒光則含有猴痘病毒，反之沒有猴痘病毒。進一步地，本專利技術檢測方法還可進行定量檢測。待測樣本被檢測出陽性后，所述方法通過對比標準曲線來對待測樣本進行猴痘病毒的濃度檢測；所述濃度檢測包括以下步驟將待測樣本和稀釋至不同濃度的權利要求I所述的檢測猴痘病毒的標準品同時按權利要求2所述的反應體系，在熒光定量PCR儀上進行擴增，反應程序63°C I分鐘，90個循環，讀取熒光值，陰性對照采用滅菌雙蒸水，反應結束后根據得到所述標準品的各個濃度的循環閾值C (t)，采用計算機自動繪制標準曲線；通過對比標準曲線來對待測樣本進行猴痘病毒的濃度檢測，將待測樣本循環閾值C (t)與所述標準曲線對照，得到待測樣本DNA中的靶基因片段拷貝濃度，按照所述拷貝濃度判斷待測樣本中猴痘病毒的濃度。本專利技術具有操作簡便，高效、快速、特異的優點。制備的標準品特異性強，堿基差異穩定，使設計的引物只針對猴痘病毒及其亞種，而不會把其他痘病毒或其他物種擴增出來，純度高，易保存。引物與整個genbank數據庫進行BLAST檢索，和其它物種的核酸序列無同源，保證了檢測方法的特異性。該方法的建立，填補了猴痘病毒恒溫核酸擴增檢測方法的空白，對樣本的檢測只需I. 5小時左右即可完成，可快速篩查猴痘病毒，對口岸輸入性疾病篩查具有重要意義，為防御疾病的傳入做好技術支撐和戰略儲備，滿足當前衛生檢疫的需求。附圖說明圖I為實施例I將特異片段克隆入pGSI質粒后的圖譜。圖2為實施例I中將轉入質粒的片段與特異序列測序的對比結果。圖3為實施例2中在25μ I體系中加入不同Mg2+濃度擴增后的電泳結果，I 為 marker :DL2000, 2 為力口入 MgSO4O. 9 μ 1，3 為 MgSO4L 05 μ 1,4 % MgSO4L 20 μ 1，5 為MgSO4L 35μ 1,6 =MgSO4L 5 μ 1,7 :陰性對照。圖4為實施例2中在不同的溫度下擴增的電泳結果，I為marker:DL2000，2為61°C，3 為 62°C，4 為 63°C，5 為 64°C，6 為 65°C。圖5為實施例2中不同濃度的標準品在熒光定量PCR儀上讀取的實施曲線，I為2. 76X IO7, 2 為 2. 76X IO6, 3 ^ 2. 76X 105，4 為 2. 76X IO4, 5 為 2. 76X 103，6 為 2. 76X本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種等溫擴增檢測猴痘病毒的試劑，其特征在于，它包括：（1）檢測猴痘病毒的標準品，所述標準品為采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI質粒，得到的重組質粒載體；所述基因片段的堿基序列如SEQ？ID？NO：1所示；（2）引物，其基因堿基序列：外引物F3：5′？CATTGATTTTTCGCGGGATA？3′；外引物B3：5′？TCCATCTCCTCCAGAATCTCC？3′；內引物FIP：5′？GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT？3′；內引物BIP：5′？TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG？3′。
【技術特征摘要】
1.ー種等溫擴增檢測猴痘病毒的試劑，其特征在于，它包括 (1)檢測猴痘病毒的標準品，所述標準品為采用人工合成的基因片段，克隆入PGSI質粒，得到的重組質粒載體；所述基因片段的堿基序列如SEQ ID NO 1所示； (2)引物，其基因喊基序列 外引物 F3 :5' -CATTGATTTTTCGCGGGATA-3'；外引物 B3 :5' -TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3'； 內引物FIP 5' -GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3'； 內引物BIP 5' -TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3'。2.ー種等溫擴增檢測猴痘病毒的方法，其特征在干 它的反應體系25μ 1，包括10Xbuffer2. 5μ 1，引物混合物I μ 1，模板DNAl μ 1，8UBstDNA 聚合酶 O. 8 μ 1，甜菜堿(8102レ 1，dNTP(10mM)2y 1，MgSO4 (IOOmM) I. 2 μ 1，I. 25 μ I熒光染料20XEva Green，_AddH20*i25yl ;反應體系中引物終濃度分別如下外引物F3和外引物B3各40pM,內引物FIP和內引物BIP各800pM ； 將上述反應體系在水浴箱上63 °C 90分鐘，或者在熒光定量PCR儀上63 °C I分鐘，9...
【專利技術屬性】
技術研發人員：呂沁風，鄭偉，吳忠華，徐琦，羅鵬，何蕾，
申請(專利權)人：浙江國際旅行衛生保健中心，
類型：發明
國別省市：
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