一種室內高通量玉米粗縮病人工接種鑒定方法技術

本發明專利技術提供了一種室內高通量玉米粗縮病人工接種鑒定方法。它包括接種體帶毒灰飛虱和一定規模玉米種子的準備，萌芽初期接種對應數量的接種體，一定時間后調查發病率評價抗性水平等步驟。本發明專利技術因其獨特的水稻黑條矮縮病毒室內活體保存技術，大大滿足了室內接種所需灰飛虱量的需求；其精準的試驗設計，不僅克服了自然接種的不穩定性，拓寬了品種抗性鑒定時間，還規范了抗性鑒定試驗；另外在接種規模上實現了突破，大大節約了試驗成本。這一方法可應用于玉米品種資源的發掘和選育、抗性評價和抗性遺傳等眾多領域。

【技術實現步驟摘要】

：本專利技術涉及一種室內高通量玉米粗縮病人工接種鑒定方法及其在農業上的應用，屬于農業科學

技術介紹
：玉米粗縮病是危害玉米的一種世界性病毒病害，由呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fjivirus)的水稻黑條矮縮病毒(Riceblackstreakeddwarfvirus，RBSDV)、馬德里約柯托病毒(MaldeRioCuartovirus，MRCV)和玉米粗縮病毒(Maizeroughdwarfvirus，MRDV)三種病毒引起。經對我國玉米粗縮病分離物測序比對研究確認引起我國玉米粗縮病的病原物為水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)，該病歷史上曾先后多次在我國玉米上暴發流行，據統計，2005年以來在河北、山東、山西、江蘇等省的夏玉米區特別是套播或晚春播、早夏播玉米上發生危害嚴重；2008年山東省發生面積達73.3萬hm2，絕產1.67萬hm2；同年在大連市也大面積發生，重病田塊發病率達60％-80％，造成了巨大的經濟損失，目前，粗縮病已經成為我國玉米上主要病害之一，對玉米生產構成了嚴重威脅。目前玉米粗縮病防治的主要措施是調整播期，其在病害防治中發揮了重要作用。但播期調整在地區間、品種間有其局限性，尤其是鮮食玉米上由于市場需求限制了播期調整的空間，因此培育并利用抗病品種成為玉米粗縮病防控上的新需求。大規模篩選玉米種質資源是培育抗性品種的基礎，對候選種質資源進行抗性鑒定是必須措施。目前對玉米粗縮病進行種質資源鑒定主要有自然鑒定法和室內人工接種鑒定法兩種。前者因其受到自然條件的約束，容易受環境條件、灰飛虱種群發生遷飛數量、帶毒率差異等因素的影響，使得鑒定結果在地區間和年度間差異較大，必須經多年多點重復鑒定才能獲得準確結果，不但增加了工作量，而且加長了育種時間；后者在前者基礎上，根據該病由灰飛虱刺吸并以持久性方式間歇傳播的特點發展起來的一種室內人工接種鑒定方法，而由于種質資源的鑒定需要大量的傳毒灰飛虱，灰飛虱人工飼養成本高，飼毒步驟復雜且毒源獲得時間有限導致帶毒灰飛虱難以獲得，難以滿足抗性鑒定的規模量需求，從而大大限制了灰飛虱人工接種鑒定的推廣應用。本實驗室經過多年對灰飛虱及其傳播病毒的研究，已經專利技術了一種水稻黑條矮縮病毒室內活體保存方法(專利號：ZL201210385208.0)，該方法可常年不間斷獲得大量高帶毒率灰飛虱，滿足了室內人工接種鑒定大量接種體的需求；另外經摸索創建了一套關于該病的高通量室內人工接種鑒定方法，該方法有效地掌握了玉米接種的敏感期，確定了適合的接種量和恰當的接種時間，從而大大提高了接種效率和精準度，節約了試驗成本，為玉米抗粗縮病的資源發掘篩選、品種選育和抗性遺傳規律研究等提供了有效的技術手段。
技術實現思路
：本專利技術針對目前玉米粗縮病自然接種鑒定準確性低而人工接種鑒定帶毒灰飛虱規模量難以實現等難題，提供了一種室內高通量玉米粗縮病人工接種鑒定方法。本專利技術的特征在于：在室內條件下，利用常年室內人工飼養的帶毒灰飛虱為接種體，一定規模數量的玉米種子在一種特定接種器中，于萌芽初期接種對應數量的接種體，接種一定時間后，移植于盆缽或大田中培養至發病顯癥，以發病率高低評價待測玉米品種對玉米粗縮病的抗性水平。在上述方法中，“常年室內人工飼養的帶毒灰飛虱”為根據專利“水稻黑條矮縮病毒室內活體保存方法(專利號：ZL201210385208.0)”的方法在室內常年人工飼養的帶毒率在30％以上的灰飛虱群體。所述的“一定規模數量的玉米種子”是指單個容器中播有效的玉米種子10～100粒。所述的“一種特定接種器”是指內徑4.5～10cm，高6～14cm的圓形或方形透光容器。所述的“于萌芽初期接種對應數量的接種體”中“萌芽初期”是指玉米種子萌動至第一張葉片頂出芽鞘前；“對應數量的接種體”是根據接種時種子萌發時間長短和玉米種子的數量接入相應數量的灰飛虱，平均接種帶毒蟲量為0.1頭/株至0.9頭/株。所述的“接種一定時間”是指接種玉米49～72小時。與已有玉米粗縮病鑒定技術相比，本專利技術提供的一種室內高通量玉米粗縮病人工接種鑒定方法，其有著諸多優點。首先，接種體大量高帶毒灰飛虱室內長期活體的保存有效地克服了灰飛虱從患病植株獲毒其植株難以長期保存的技術瓶頸，拓寬了鑒定的時間，滿足了種質資源鑒定接種體量的需求；其次，特定接種容器“內徑4.5～10cm，高6～14cm的圓形或方形透光容器”因其較強的透光性保證了一定規模玉米種子的健康生長；再次，反復試驗掌握了玉米萌芽初期為接種的敏感期，確定了有效接種蟲量為0.1頭/株～0.9頭/株，接種時間為49～72小時，大大提高了接種效率。這一鑒定方法不僅實現了玉米粗縮病室內人工接種鑒定的高通量需求，應用于玉米資源的發掘和選育、抗性應用評價，還可應用于抗病基因定位的表型鑒定及抗性遺傳規律研究等眾多領域，從而為玉米研究提供了強有力的技術支撐。具體實施方式：下面通過具體實施例來進一步說明本專利技術，所用方法如無特別說明均為常規方法。以下實施例中飼養灰飛虱和人工接種的基礎設施如下：具有調溫和光照設備的養蟲室，使溫度保持在25～28℃之間并保證每天12h的光照時間；50～1000mL的玻璃燒杯、尼龍紗布(網眼規格1mm)、不銹鋼養蟲架、微電腦時控開關、飼喂灰飛虱的水稻和小麥種子(水稻：武育粳3號；小麥：揚麥158)；轉移灰飛虱用的黑布、毛筆、吸蟲器等。實施例1，玉米品種對玉米粗縮病抗性的室內人工接種鑒定方法①一定規模高帶毒(RBSDV)灰飛虱的獲得。根據專利“水稻黑條矮縮病毒室內活體保存方法(專利號：ZL201210385208.0)”中的方法在養蟲室內常年獲得高帶毒率灰飛虱(帶毒率30％以上)，再利用專利“一種室內大量飼養灰飛虱的方法(專利號：ZL201410298198.6)在室內大規模飼養高帶毒灰飛虱，即可獲得一定規模的高帶毒(RBSDV)灰飛虱。研究表明10m2養蟲室可在室內一批飼養50000頭左右，帶毒率30％以上的灰飛虱。②接種器具的確定采用100、200和300mL塑料杯、50、250、500和1000mL玻璃燒杯等進行玉米種子育苗試驗，經比較不同容器中玉米種子發芽率有差異，但差異不顯著，因此可根據需要進行選擇，即選用內徑4.5～10cm，高6～14cm的透明容器為育苗接種器具。③接種量的確定接種強度按有效接種蟲量(有效接種蟲量＝接種蟲量×帶毒率)設置0.1～0.9頭/株共9個處理，重復3次。將感病品種蘇951的36粒種子浸本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種室內高通量玉米粗縮病人工接種鑒定方法，其特征在于：在室內條件下，利用常年室內人工飼養的帶毒灰飛虱為接種體，一定規模數量的玉米種子在一種特定接種器中，于萌芽初期接種對應數量的接種體，接種一定時間后，移植于盆缽或大田中培養至發病顯癥，以發病率高低評價待測玉米品種對玉米粗縮病的抗性水平。

【技術特征摘要】
1.一種室內高通量玉米粗縮病人工接種鑒定方法，其特征在于：在室內條件下，利用常
年室內人工飼養的帶毒灰飛虱為接種體，一定規模數量的玉米種子在一種特定接種器中，
于萌芽初期接種對應數量的接種體，接種一定時間后，移植于盆缽或大田中培養至發病顯
癥，以發病率高低評價待測玉米品種對玉米粗縮病的抗性水平。
2.根據權利要求1所述的一種室內高通量玉米粗縮病人工接種鑒定方法，其特征在于
所述的常年室內人工飼養的帶毒灰飛虱為根據專利“水稻黑條矮縮病毒室內活體保存方法
(專利號：ZL201210385208.0)”的方法在室內常年人工飼養的帶毒率在30％以上的灰飛虱
群體。
3.根據權利要求1所述的一種室內高通量玉米粗縮病人工接種鑒定方法，其特征在于
所述的一定規...

【專利技術屬性】
技術研發人員：任春梅，程兆榜，楊柳，繆倩，陸芳，陶亞群，周益軍，
申請(專利權)人：江蘇省農業科學院，
類型：發明
國別省市：江蘇;32