本發明專利技術涉及一種基于實時核酸序列依賴性擴增（Nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA）技術的腸道病原體快速檢測技術，具體提供了一種諾如病毒實時等溫擴增檢測試劑盒及其一對引物和一條分子信標探針。所述試劑盒包括含有上述引物和探針的2×實時NASBA反應液、5×酶混合液及陽性對照模板、陰性對照和空白對照。所述引物和探針序列是序列編號為SEQ?ID?NO：1～3所示的序列，能特異性擴增和檢測諾如病毒ORFs1基因片段。本發明專利技術的試劑盒具有快速、高效、敏感特異和實時檢測分析等特點，可應用于臨床和口岸的常規檢測和疾病防控領域。????
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種基于實時核酸序列依賴性擴增（Nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA）技術的腸道病原體快速檢測技術。具體涉及諾如實時NASBA等溫擴增快速檢測試劑盒；還涉及所述試劑盒中使用的對于諾如病毒基因組具有特異性的引物對和分子信標探針。
技術介紹
諾如病毒（Norovirus，NV）又稱諾瓦克樣病毒，以諾瓦克病毒(Norwalk?virus)為代表，是一種分布很廣泛的，可導致成人和兒童急性胃腸炎的病毒，是除輪狀病毒外引起腹瀉的最主要的病毒病原，與食物、水源等的污染造成的急性胃腸炎暴發密切相關。諾如病毒基因組是單股正鏈RNA，全長7642nt，包括3個開放閱讀框（open?reading?frames,ORFs）ORFs1、ORFs2和ORFs3。ORFs1編碼保守的具有RNA多聚酶活性的非結構蛋白；ORFs2編碼分子量約為56Kda的衣殼蛋白；ORFs3編碼一種分子量約為22.5Kda的強堿性微小結構蛋白，部分區域與衣殼蛋白發生交互作用，共同形成衣殼。盡管諾如病毒引起的急性胃腸炎癥狀(嘔吐、腹瀉和腹部痙攣等)呈自限性，但若治療不及時仍會導致死亡，所以檢測該病毒的感染情況對于疾病控制和臨床診斷均具有重要意義。因此，一套簡便快速、特異性強的諾如病毒檢測方法，可以為腹瀉病的防控和臨床診斷提供有力的技術支持。目前，針對諾如病毒的檢測，經典的方法有電鏡觀察、核酸雜交、酶聯免疫等。電鏡觀察不但敏感度低、而且價格昂貴、設備和技術條件要求甚高，無法應用于臨床常規檢測和大規模的流行病學調查；核酸雜交及酶聯免疫檢測因技術本身的限制，其靈敏度均比較低，漏檢率高。隨著分子生物學與生物信息學的快速發展和有機結合，基于核酸擴增的技術發展迅速，日新月異。如逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）是一種檢測RNA類病毒的簡便、準確的常規技術。但是，基于PCR的技術是終點法分析，需要反復升降溫的循環擴增和PCR后的凝膠電泳分析結果，耗時較長，且靈敏度仍有待提高。之后，無需電泳分析的實時熒光RT-PCR成為更快捷的一種核酸擴增和RNA病毒檢測技術。該技術利用熒光探針實現對靶核酸的特異性檢測，利用熒光信號的積累實現實時監測PCR擴增反應的全過程從而能實時分析檢測結果。由于實時熒光RT-PCR仍需要有反轉錄步驟和變性、退火及延伸等三個溫度點進行幾十次升降溫循環，每個溫度點和時間也需精確設定，整個反應仍需耗時2～2.5小時以上。近年來，一種新型的核酸擴增技術—等溫擴增技術實現在恒溫條件下的檢測。如DNA環介導等溫擴增技術（Loop-mediated?Isothermal?Amplification?of?DNA，LAMP）應用的比較廣泛，也有相關專利申請，但LAMP技術需要使用4條引物，一共識別靶DNA的6個不同區域，雖然提高了特異性，但針對變異大的病毒核酸分子在設計上非常困難。核酸序列依賴性擴增（Nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA）技術是另一種快速等溫擴增技術，它克服了以往核酸擴增的不足，更為簡便高效，尤其適用于RNA病毒的檢測。與PCR不同，NASBA是在AMV反轉錄酶、RNA酶H、T7?RNA聚合酶等三種酶的共同協作下，在41～42℃，由一對引物指導的連續均一的體外特異核苷酸序列等溫擴增酶促過程。其中一條引物其5’端具有被T7?RNA聚合酶識別的啟動子序列。在NASBA基礎上結合分子信標（molecular?beacon）探針可以建立實時NASBA（Real-time?NASBA）等溫擴增技術。該技術具有以下優點：（1）等溫擴增：反應在同一恒溫體系條件下進行；（2）快速高效、靈敏度高：實時NASBA反應是一種無需升降溫的連續快速擴增，也不需RT-PCR反應中第一階段15～30分鐘的反轉錄過程，整個反應時間短、單鏈RNA產物積累迅速，可以在60～90分鐘內完成檢測，并使模板RNA擴增109倍以上，靈敏度甚至可以達到檢測拷貝數為個位的模板RNA。例如目前針對A型禽流感病毒所有亞型研發的NASBA/ECL檢測試劑盒，其正式發表的實驗數據顯示，NASBA技術比目前商品化的免疫檢測試劑盒敏感10～1000倍，比常規PCR方法也敏感許多；（3）特異性高、實時檢測：反應不需高溫變性，即使有雙鏈DNA污染也不會被擴增，而通過分子信標探針的檢測進一步提高了特異性和靈敏度，也實現了實時檢測和結果分析；（4）設計簡單：它只需設計1對引物和1條探針來識別靶RNA的3個不同區域，對于檢測變異度高的病毒核酸來說，設計上相對LAMP技術更為容易。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種基于實時NASBA（Real-time?NASBA）技術的對諾如病毒基因組具有特異性檢測作用的引物；本專利技術還提供了一種基于實時NASBA（Real-time?NASBA）技術的對諾如病毒基因組具有特異性檢測作用的分子信標探針；此外本專利技術還提供了一種利用上述引物對和分子信標探針基于實時核酸序列依賴性擴增（Real-time?NASBA）技術檢測諾如病毒的檢測試劑盒。本專利技術一種諾如病毒檢測用引物所采用的技術方案是，本專利技術包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的堿基序列表示如下：正向引物F1：5’-TGGAAYTCCATYGCCCACTG-3’；反向引物R1：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTRCTNACAATYTCATCATCACC-3’。所述反向引物R1的5’端的25個堿基是增加的T7噬菌體啟動子序列，而3’端23個堿基是與諾如病毒ORFs1互補的特異性序列，所述正向引物F1和所述反向引物R1的3’端的病毒核酸變異位點使用簡并堿基。本專利技術一種諾如病毒檢測用分子信標探針所采用的技術方案是，所述分子信標探針的堿基序列表示如下：分子信標探針P1：5’-ROX-CCGAGCTGTGCVCTBTCYGARRTBACGCTCGG-DABCYL-3’，所述分子信標探針P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團ROX，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL，病毒核酸變異位點使用簡并堿基。本專利技術一種諾如病毒實時等溫擴增檢測試劑盒所采用的技術方案是，所述試劑盒至少包括2×實時NASBA反應液和5×酶混合液，所述2×實時NASBA反應液包含有如上所述的正向引物F1和反向引物R1以及分子信標探針P1。所述2×實時NASBA反應液包括如表1所示的組分：??????????????????表1??2×實時NASBA反應液??????????????????表2??5×酶混合液所述5×酶混合液包括如下組分：所述試劑盒還包括陽性對照、陰性對照和空白對照。所述陽性對照為諾如病毒體外轉錄的基因組RNA片段。所述陰性對照為在核酸提取時與標本同時平行提取無菌生理鹽水。所述空白對照為無核酸酶的超純水。本專利技術的有益效果是：本本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種諾如病毒檢測用引物，其特征在于，包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的堿基序列表示如下：正向引物F1：5’？TGGAAYTCCATYGCCCACTG？3’；反向引物R1：5’？AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTRCTNACAATYTCATCATCACC？3’。
【技術特征摘要】
1.一種諾如病毒檢測用引物，其特征在于，包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的堿基序列表示如下：
正向引物F1：5’-TGGAAYTCCATYGCCCACTG-3’；
反向引物R1：
5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTRCTNACAATYTCATCATCACC-3’。
2.根據權利要求1所述的一種諾如病毒檢測用引物，其特征在于：所述反向引物R1的5’端的25個堿基是增加的T7噬菌體啟動子序列，而3’端23個堿基是與諾如病毒ORFs1互補的特異性序列，所述正向引物F1和所述反向引物R1的3’端的病毒核酸變異位點使用簡并堿基。
3.一條諾如病毒檢測用分子信標探針，其特征在于，所述分子信標探針的堿基序列表示如下：
分子信標探針P1：
5’-ROX-CCGAGCTGTGCVCTBTCYGARRTBACGCTCGG-DABCYL-3’，
所述分子信標探針P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團ROX，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL。
4.根據權利要求3所述的一條諾如病毒檢測用分子信標探針，其特征在于：所述分子信標探針P1的5’端和3’端的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：莫秋華，馮子力，李衛崗，楊澤，林繼燦，劉志明，杜堅，
申請(專利權)人：珠海國際旅行衛生保健中心，
類型：發明
國別省市：
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