病原微生物核酸無擴增檢測與分型方法技術

本發明專利技術公開了一種病原微生物核酸無擴增檢測和分型方法以及相關的試劑盒，本發明專利技術以多探針并結合熒光量子點層層組裝技術，實現病原微生物核酸無擴增檢測和分型。本發明專利技術的方法對于低濃度核酸無需擴增，可以直接檢測；多探針保證了信號放大過程中容易出現的假陽性問題，提高了檢測準確性，該技術可以實現病原微生物拷貝數的實時檢測與同步基因分型，速度快，成本低廉。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫藥生物領域，尤其涉及一種病原微生物核酸無擴增直接檢測與分型方法及試劑盒。
技術介紹
感染性疾病是嚴重危害人類健康的最重要疾病之一。據國家疾控中心(⑶C)統計2011年我國法定傳染病發病632萬例，死亡I. 5萬人。其中病毒性肝炎、肺結核和梅毒的發病率位居前三位，占乙類傳染病發病總數的85. 41%。且乙型肝炎、丙型肝炎等血源性傳染病的發病率呈逐年上升趨勢。上述數據表明，乙型病毒性肝炎仍占據我國感染性疾病發病率首位，其發病人數亦占我國肝炎發病總人數的70%以上。大量臨床資料和研究表明，乙型病毒性肝炎患者的血清學轉歸和預后與所感染乙型肝炎病毒(HBV)的基因型及拷貝數密切相關。因此，建立快速、準確的HBV檢測與分型方法對于乙型病毒性肝炎的早期診斷、療效監測、預后判斷和個體化治療具有重要臨床意義。對于HBV感染的檢測，目前的實驗室方法主要分為直接檢測和間接檢測兩大類。 其中間接檢測以生物化學方法和免疫學為主。生物化學方法通過檢測多項轉氨酶(ALT， AST, γ-GGT等)的升高來間接判斷病毒感染，其靈敏度較高，但易受其它原因導致的肝損傷影響，故特異性差。免疫法包括早期的ELISA和逐漸發展形成的免疫散射比濁、化學發光和時間分辨熒光檢測等技術。其原理是通過同時檢測多項HBV特征性抗原(HBsAg、HBcAg、 HBeAg)和患者機體產生的相應抗體(HBsAb、HBcAb)來進行綜合判定。該方法簡便易行，在臨床上廣為應用。但是免疫學方法無法檢出處于“窗口期”的HBV感染，易導致假陰性。最重要的是，所有間接檢測方法都無法對HBV進行基因型分型，因而無法指導個體化臨床用藥。直接檢測法則檢測患者樣本中的HBV的數量和基因亞型，具有早期、實時、動態監測HBV拷貝數變化的特點，在早期診斷、療效判斷、個體治療等方面具有無可比擬的優勢。 因病毒在體外極難培養，因此目前病毒直接檢測技術均通過檢測HBV核酸實現。然而，由于早期HBV感染患者體內的HBV拷貝數較低(通常104-106/ml)，不足以被核酸雜交等常規分子生物學方法直接檢出。因此進行靶分子信號放大是實現HBV DNA高分辨檢測與分型的前提。目前的信號放大策略主要包括兩類DNA模板擴增技術(前放大)和檢測信號放大技術 (后放大)。其中DNA模板擴增技術以PCR為基礎，通過體外擴增核酸分子模板至IO9倍， 以實現信號放大。PCR技術相繼衍生出一系列變溫核酸擴增、檢測技術，如巣式PCR，熒光定量PCR和多重PCR等。這些基于PCR的擴增技術用于HBV檢測與分型尚存在以下不足(I) 對擴增條件要求極為嚴格，極易產生假陽性或者假陰性。(2)多基因型同步擴增時常導致高濃度模板對低濃度模板的競爭抑制，導致低濃度樣本的假陰性結果。(3) PCR相關技術核心知識產權的壁壘導致了其相關試劑和設備價格昂貴，增加了醫療成本和患者負擔。近年來， 相繼發展出一系列等溫擴增技術，如鏈置換擴增(SDA)，環介導等溫擴增(LAMP)，滾環擴增 (RCA)等技術，部分降低了醫療成本和解決了上述低濃度模板擴增受抑制等不足。然而這些技術仍然無法解決同步進行HBV高分辨檢測和基因分型的難題。相對于DNA模板擴增技術而言，檢測信號放大(后放大)技術僅對已檢測到的低信號進行放大，可消除因不同濃度模板擴增導致的擴增性抑制。由于檢測信號放大技術是與檢測原理緊密聯系的，因此每個檢測技術平臺都有自己最適合的信號放大技術。如基于石英晶體微天平(QCM)傳感器的質量放大，基于表面等離子體(SPR)傳感器的折射光角度放大，基于電化學傳感器的酶學放大，基于熒光檢測的納米傳感器的熒光增強等。在這些檢測平臺中，均需使用生物傳感技術將低于檢測限的微弱信號轉化為可以識別的物理或者化學信號。以前使用最多的是酶化學傳感器，其原理是通過酶的催化或者與底物的結合進行信號放大。近年來，納米材料合成、表面修飾技術的飛速發展為信號放大技術的研發提供了廣闊空間。專利技術人前期在納米材料信號放大方面進行了大量研究，成功將納米金顆粒用于 QCM傳感器的信號放大，實現了血液中低濃度金黃色葡萄球菌的檢測；同時也實現了 HCR反應的無酶熒光信號放大。然而，試驗中我們發現，傳統熒光染料極易被漂白，用于臨床樣本檢測難度較大。然而，HBV的A-H亞型間的序列同源性非常高，利用核酸雜交技術對其進行分型需要制備特異性極高的探針。因此目前存在的HBV分型技術則采用PCR首先將各亞型歸類， 然后用多組DNA探針分別檢測不同組別的基因型以提高檢測特異性。相比DNA分子而言， 肽核酸(PNA)分子因其獨特的碳鏈骨架結構，其與DNA單鏈結合的親和常數較普通DNA-DNA 的結合常數高IO3倍，因此短鏈PNA探針(14-20bp)對于單堿基突變具有極強的識別能力， PNA探針的這種高特異識別能力為HBV病毒的基因分型提供了新的突破口。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于提供一種病原微生物核酸無擴增檢測和分型方法。為了實現本專利技術的目的，擬采用如下技術方案本專利技術涉及一種病原微生物核酸無擴增檢測和分型方法，其特征在于包括如下步驟(I)根據待測樣品的核酸序列合成DNA和/或PNA探針1，2，3，所述的探針1，2，3 能夠分別與待測樣品雜交并且互不重疊；(2)分別將探針1，2，3與磁性納米顆粒和兩種熒光量子點耦聯，所述的熒光量子點的熒光可以相同，也可以不相同。(3)合成生物素連接的橋連DNA合/或PNA序列1，2以及互補的序列1’，2’，將序列I’和2’與步驟(2)中的兩種熒光量子點分別耦聯；(4)合成兩種生物素修飾的熒光顏色不同的兩種熒光量子點，這兩種熒光量子點可以與步驟(2)中的熒光量子點相同，也可以不同；(5)選擇步驟(2)中的探針修飾的磁性納米顆粒和其中一種探針修飾的熒光量子點，將其與待測樣品以及相應的橋連序列進行雜交并進行磁性分離；然后通過重復加入 Sa (中文全稱)_洗滌-加入步驟(4)中的其中一種生物素修飾的熒光量子點-洗滌的步驟進行層層組裝，然后通過磁性分離得到待測樣品的富集物，任選地，對富集物的樣品進行熒光強度測定；(6)選擇另外一種探針修飾的熒光量子點，將其與步驟(5)獲得的富集物以及相應的橋連序列進行雜交并進行磁性分離；然后通過重復加入Sa (中文全稱)-洗滌-加入步驟(4)中的另外一種生物素修飾的熒光量子點-洗滌的步驟進行層層組裝，然后通過磁性分離得到待測樣品的第二富集物，任選地，對第二富集物的樣品運用熒光光譜成像技術或者流式細胞儀技術進行檢測。本專利技術另一方面還涉及種病原微生物核酸無擴增檢測和分型的試劑盒，其特征在于包括三種DNA和/或PNA探針耦聯的磁性納米顆粒和兩種熒光量子點，所述的三種探針能夠分別與待測樣品雜交并且互不重疊，熒光量子點的熒光可以相同，也可以不相同；生物素修飾的橋連DNA和/或PNA，橋連DNA和/或PNA的互補序列耦聯的兩種熒光量子點；生物素修飾的熒光顏色不同的兩種熒光量子點，這兩種熒光量子點可以與上述熒光量子點的熒光相同，也可以不同；SA以及緩沖溶液。在本專利技術的一個優選實施方式中,其特征在于待測樣品為HBV核酸。在本專利技術的一個優選實施方式中，所述的探針為PNA，所述的熒光量子點中的一個或多個或全部為CdSe/ZnS量本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種病原微生物核酸無擴增檢測和分型方法，其特征在于包括如下步驟：(1)根據待測樣品的核酸序列合成DNA和/或PNA探針1，2，3，所述的探針1，2，3能夠分別與待測樣品雜交并且互不重疊；(2)分別將探針1，2，3與磁性納米顆粒和兩種熒光量子點耦聯，所述的熒光量子點的熒光可以相同，也可以不相同。(3)合成生物素連接的橋連DNA合/或PNA序列1，2以及互補的序列1’，2’，將序列1’和2’與步驟(2)中的兩種熒光量子點分別耦聯；(4)合成兩種生物素修飾的熒光顏色不同的兩種熒光量子點，這兩種熒光量子點可以與步驟(2)中的熒光量子點相同，也可以不同；(5)選擇步驟(2)中的探針修飾的磁性納米顆粒和其中一種探針修飾的熒光量子點，將其與待測樣品以及相應的橋連序列進行雜交并進行磁性分離；然后通過重復加入Sa(鏈霉親和素)?洗滌?加入步驟(4)中的其中一種生物素修飾的熒光量子點?洗滌的步驟進行層層組裝，然后通過磁性分離得到待測樣品的富集物，任選地，對富集物的樣品進行熒光強度測定；(6)選擇另外一種探針修飾的熒光量子點，將其與步驟(5)獲得的富集物以及相應的橋連序列進行雜交并進行磁性分離；然后通過重復加入Sa?洗滌?加入步驟(4)中的另外一種生物素修飾的熒光量子點?洗滌的步驟進行層層組裝，然后通過磁性分離得到待測樣品的第二富集物，任選地，對第二富集物的樣品運用熒光光譜成像技術或者流式細胞儀技術進行檢測。...

【技術特征摘要】
1.ー種病原微生物核酸無擴增檢測和分型方法，其特征在于包括如下步驟 (1)根據待測樣品的核酸序列合成DNA和/或PNA探針1，2，3，所述的探針1，2，3能夠分別與待測樣品雜交并且互不重疊； (2)分別將探針1，2，3與磁性納米顆粒和兩種熒光量子點耦聯，所述的熒光量子點的熒光可以相同，也可以不相同。(3)合成生物素連接的橋連DNA合/或PNA序列1，2以及互補的序列I’，2’，將序列I’和2’與步驟(2)中的兩種熒光量子點分別耦聯； (4)合成兩種生物素修飾的熒光顏色不同的兩種熒光量子點，這兩種熒光量子點可以與步驟(2)中的熒光量子點相同，也可以不同； (5)選擇步驟(2)中的探針修飾的磁性納米顆粒和其中ー種探針修飾的熒光量子點，將其與待測樣品以及相應的橋連序列進行雜交并進行磁性分離；然后通過重復加入Sa(鏈霉親和素)-洗滌-加入步驟(4)中的其中ー種生物素修飾的熒光量子點-洗滌的步驟進行層層組裝，然后通過磁性分離得到待測樣品的富集物，任選地，對富集物的樣品進行熒光強度測定； (6)選擇另外ー種探針修飾的熒光量子點，將其與步驟(5)獲得的富集物以及相應的橋連序列進行雜交并進行磁性分離；然后通過重復加入Sa-洗滌-加入步驟(4)中的另外ー種生物素修飾的熒光量子點-洗滌的步驟進行層層組裝，然后通過磁性分離得到待測樣品的第二富集物，任選地，對第二富集物的樣品運用熒光光譜成像技術或者流式細胞儀技術進行檢測。2.ー種病原微生物核酸無擴增檢測和分...

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅陽，張波，蔣天倫，府偉靈，劉煒，
申請(專利權)人：重慶西南醫院，
類型：發明
國別省市：