本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種用于檢測(cè)評(píng)價(jià)亞甲藍(lán)光化學(xué)法病毒滅活效果的方法，以去除生物活性的SV病毒為質(zhì)控品，在相同條件下對(duì)質(zhì)控品和需要進(jìn)行病毒滅活的血液或血液制品在相同條件下進(jìn)行亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活。該方法對(duì)人體沒(méi)有病毒感染風(fēng)險(xiǎn)，可通過(guò)質(zhì)控品核酸損傷的程度反映HCV病毒感染性消失的情況。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種病毒滅活檢測(cè)方法，尤其涉及一種PCR技術(shù)檢測(cè)評(píng)價(jià)亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活HCV病毒效果的方法。
技術(shù)介紹
輸血是臨床上治療和搶救病人常用的醫(yī)療措施。近年來(lái)，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，血液及血液制品的安全性越來(lái)越受到人們的重視。輸血安全不僅是輸血醫(yī)學(xué)和臨床治療學(xué)追求的期望目標(biāo)，也是采供血機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)乃至社會(huì)各界共同關(guān)注的熱點(diǎn)和極端敏感的永恒課題。目前，已知有多種病毒可經(jīng)血液傳播，如HIV1/2、HTLVI/II、肝炎病毒HBV和HCV、·HDV和HEV、HAV、非甲 戊肝炎病毒(HGV、TTV, SENV)、CMV和EBV、小病毒B19和新克雅氏病毒等等，都有可能引起輸血后病毒性傳染病，其中尤其以脂質(zhì)包膜病毒如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和艾滋病毒(HIV)危害最大。目前認(rèn)為提高血液安全性的措施主要是(I)合理的選擇獻(xiàn)血員、(2)嚴(yán)格的病毒篩選、(3)有效的病毒滅活技術(shù)。盡管目前血液檢查水平在不斷的提高，但是由于檢查“窗口期”的存在、以及病毒變異導(dǎo)致免疫反應(yīng)性的改變、免疫靜默感染、新型病毒和亞型變異株的出現(xiàn)等仍使輸血時(shí)刻存在著風(fēng)險(xiǎn)。采用有效的血液病毒滅活技術(shù)是保證輸血安全的重要措施之一，也是從根本上解決輸血傳播病毒風(fēng)險(xiǎn)的有效方法，多年來(lái)國(guó)外傳統(tǒng)病毒滅活方法為巴斯德液體濕熱滅活法、有機(jī)溶劑/洗滌劑法、干熱法、膜過(guò)濾法、低PH值孵放法等等，巴斯德液體濕熱滅活法主要用于人血白蛋白制品，有機(jī)溶劑/洗滌劑法可用于混合血漿，干熱法用于凍干制品，膜過(guò)濾法只有濾膜孔徑比病毒有效直徑更小時(shí)才能有效去除病毒，而且不能單獨(dú)使用。上述方法處理難度大、費(fèi)用高，不能廣泛應(yīng)用于臨床用單袋血漿(如100 ml,200 ml)的病毒滅活。由于目前全國(guó)各地血站供臨床使用的血漿均為單人份血漿，其可能內(nèi)含的脂質(zhì)包膜病毒，對(duì)人體健康有潛在危害，為了克服此危害，必須對(duì)脂質(zhì)包膜病毒滅活，大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，用亞甲蘭光化學(xué)處理血漿可完全滅活血漿內(nèi)所含的VSV和Sindbis病毒(這兩種病毒是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的血液制品病毒滅活有效性的指示病毒，其中VSV作為RNA質(zhì)包膜病毒的模型病毒，Sindbis作為HCV的模型病毒，均為RNA脂質(zhì)包膜病毒)。光化學(xué)法主要是依靠光敏劑在光照下產(chǎn)生的單線態(tài)氧或自由基氧化損傷病毒的分子結(jié)構(gòu)，從而殺滅病毒，各種光敏劑的作用特點(diǎn)不盡相同，如補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物主要產(chǎn)生自由基(一類機(jī)制)，酞菁類光敏劑主要產(chǎn)生單線態(tài)氧(二類機(jī)制)，而酚噻嗪類光敏劑可能同時(shí)涉及兩類機(jī)制，例如單線態(tài)氧和光敏劑介導(dǎo)的自由基可能都參與了亞甲蘭(MB)光化學(xué)處理對(duì)病毒的滅活。亞甲藍(lán)(Methylene Blue Photochemistry, MB)光化學(xué)滅活血衆(zhòng)病毒是一種最安全、有效的適合于臨床用單袋血漿病毒滅活的方法，被認(rèn)為是非常有發(fā)展前景的臨床應(yīng)用單人份血漿病毒滅活方法，早在1966年P(guān)ohl和Mohl發(fā)表了使用亞甲藍(lán)和光照滅活病毒血漿的臨床經(jīng)驗(yàn)，自1993年起已在德國(guó)、瑞士等多個(gè)歐洲國(guó)家紅十字會(huì)輸血中心使用，并收到良好的臨床效果，2001年亞甲藍(lán)滅活病毒方法在上海血液中心研制成功之后，國(guó)內(nèi)大部分血液中心和中心血站已開(kāi)展此項(xiàng)目。由于病毒滅活技術(shù)受到多種因素的影響，因此建立有效的病毒滅活驗(yàn)證方法、直接而客觀的評(píng)價(jià)病毒滅活的有效性是病毒滅活工作的重要組成部分，也是確保滅活效果達(dá)到預(yù)期要求、保障血液和血液制品安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前多采用體外培養(yǎng)的細(xì)胞病變法或動(dòng)物模型法來(lái)判斷病毒滅活效果，體外培養(yǎng)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件有著嚴(yán)格的要求，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)、病毒保存有著嚴(yán)格規(guī)范，操作繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，不利于在基層單位開(kāi)展，并且因其基于在體外觀察病毒靶細(xì)胞病變的原理而難以評(píng)價(jià)其靶細(xì)胞無(wú)法在體外培養(yǎng)的病毒(如肝炎病毒)的滅活效果；雖然動(dòng)物模型方法從生物整體水平評(píng)價(jià)病毒感染性方面具有優(yōu)勢(shì)，但是價(jià)格昂貴、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，只適用于研究開(kāi)發(fā)階段實(shí)驗(yàn)，而且對(duì)多數(shù)人類致病病毒缺乏敏感的模型動(dòng)物，不適合在常規(guī)工作中開(kāi)展，因此建立更簡(jiǎn)便易行、更經(jīng)濟(jì)、更有效的評(píng)價(jià)指標(biāo)已成為病毒滅活工作急需解決的問(wèn)題。核酸檢測(cè)技術(shù)是以檢測(cè)樣本內(nèi)病毒核酸的有無(wú)或含量多少進(jìn)行病原學(xué)診斷的一種方法，是繼形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)診斷之后的第四代診斷檢測(cè)技術(shù)，靈敏度高、特異 性強(qiáng)，能夠采用定量檢測(cè)的方法進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，具有準(zhǔn)確性高、檢測(cè)成本低、耗時(shí)少的優(yōu)點(diǎn)，已被用作病毒感染的常規(guī)診斷方法，其中PCR檢測(cè)是眾多核酸檢測(cè)技術(shù)中的經(jīng)典方法，因其簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，很容易被基層檢驗(yàn)單位及血站所接受。在病毒滅活有效性評(píng)價(jià)工作中，病毒滅活質(zhì)控品的建立是至關(guān)重要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供了一種檢測(cè)評(píng)價(jià)亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活HCV病毒效果的方法，以辛德畢斯(Sindbis Virus，SV)病毒為質(zhì)控品，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增SV病毒基因特定區(qū)域，檢測(cè)亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活處理效果，從分子水平對(duì)亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活效果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。本專利技術(shù)亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活HCV病毒效果的檢測(cè)方法，步驟如下 步驟1，將SV病毒加熱去除生物活性，使SV病毒失去毒性，不能致人體細(xì)胞病變,并使SV病毒核酸載量保持IO9以上；以去除生物活性的SV病毒作為質(zhì)控品； 步驟2，在相同條件下對(duì)血液和質(zhì)控品進(jìn)行亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活，PCR檢測(cè)質(zhì)控品亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活前后病毒核酸量的變化，判斷病毒滅活效果，質(zhì)控品核酸損傷效果即為HCV病毒核酸損傷效果，即病毒滅活效果。上述方法中，首先將SV病毒加熱去除生物活性，具體為在56 °C進(jìn)行孵育，使其核酸載量保持IO9以上；孵育時(shí)間優(yōu)選為2小時(shí)。上述的方法中，所述PCR檢測(cè)可以是長(zhǎng)鏈PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)、或其它已知PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。其中，所述PCR檢測(cè)方法為針對(duì)SV病毒復(fù)制酶編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，對(duì)滅活前后的病毒進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體為針對(duì)SV病毒基因7548 7566片段設(shè)計(jì)下游引物，針SV病毒基因7383 7400、6540 6558、4839 4856、3519 3537、中的任意片段設(shè)計(jì)上游引物，對(duì)SV病毒cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。優(yōu)選地，所述引物如下引物I序列I片段位置下游引物 5’ -CTCTGATGGCTTGGATGC-3’_7548^7566I游引物 I 丨5’-GACGAGCAAGACGAAGAC-3，卜383~7400本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活HCV病毒效果的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟如下：步驟1，將SV病毒加熱去除生物活性，使SV病毒失去毒性，不能至人體細(xì)胞病變，并使SV病毒核酸載量保持109以上；以去除生物活性的SV病毒作為質(zhì)控品；步驟2，在相同條件下對(duì)血液和質(zhì)控品進(jìn)行亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活，PCR檢測(cè)質(zhì)控品亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活前后病毒核酸量的變化，判斷病毒滅活效果，質(zhì)控品核酸損傷效果即為HCV病毒滅活效果。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活HCV病毒效果的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟如下 步驟1，將SV病毒加熱去除生物活性，使SV病毒失去毒性，不能至人體細(xì)胞病變，并使SV病毒核酸載量保持IO9以上；以去除生物活性的SV病毒作為質(zhì)控品； 步驟2，在相同條件下對(duì)血液和質(zhì)控品進(jìn)行亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活，PCR檢測(cè)質(zhì)控品亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活前后病毒核酸量的變化，判斷病毒滅活效果，質(zhì)控品核酸損傷效果即為HCV病毒滅活效果。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述SV病毒加熱至56°C孵育，去除生物活性。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述SV病毒孵育時(shí)間為2小時(shí)。4.根據(jù)上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述PCR檢測(cè)為長(zhǎng)鏈PCR檢測(cè)或熒光定量PCR檢測(cè)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR檢測(cè)方法為針對(duì)SV病毒基因7548 7566片段設(shè)計(jì)下游引物，針SV病毒基因73...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭嵐，張博，王迅，黃宇聞，莫琴，錢(qián)開(kāi)誠(chéng)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海市血液中心，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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