本發明專利技術公開了一種檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物、試劑盒及檢測方法，能夠快速、簡便、準確的檢測膀胱癌尿液中miRNA-155的表達量。該專用試劑盒包括檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用逆轉錄引物和檢測引物以及RNA分離液；RNA分離液由2.5%吐溫20、50mmol/L三羥甲基氨基甲烷、1mmol/L乙二胺四乙酸和1%牛血清白蛋白組成。本發明專利技術為膀胱癌的早期發現、早期治療提供了重要的參考依據。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物、試劑盒，以及檢測膀胱癌尿液miRNA-155表達量的方法，屬于分子生物學檢測
技術介紹
膀胱癌是泌尿生殖系統中最常見的惡性腫瘤，在我國的發病率和死亡率均占男性泌尿生殖系統腫瘤的首位，且呈逐年上升趨勢。膀胱癌患者初診時30%已發生肌層浸潤，而在非肌層浸潤性膀胱癌患者中，仍有30%會復發為浸潤性膀胱癌。早期診斷和早期治療是預防和控制膀胱癌的關鍵。目前臨床上診斷膀胱癌主要依賴于膀胱鏡、尿脫落細胞學和影像學檢查等。膀胱鏡是膀胱癌診斷的常用方法，可造成不同程度的尿道和膀胱損傷以及感染等并發癥；尿脫落細胞學檢查具有非侵入性、特異性高等優點，其敏感性低于50%，對早期患者僅為30%，易受檢測者主觀因素的影響；CT和超聲檢查是目前診斷膀胱癌及術前分期最常用的影像學檢查方法，但對膀胱內較小病變不易發現，對膀胱癌分期預測受到一定限制。尋找敏感性、特異性高的早期診斷生物標志物，建立一種經濟準確、安全有效的血清學膀胱癌診斷方法是目前關注的焦點。miRNAs是在真核生物中 發現的一類具有調控功能的內源性非編碼小分子RNA，其通過對mRNA的完全和部分配對結合，降解mRNA或干擾mRNA的翻譯，在轉錄后水平調控特定基因的表達，從而對細胞增殖、分化與凋亡起到精細調節的作用。近年來研究發現，尿液中存在豐富穩定的miRNAs，其與泌尿系統惡性腫瘤的發生、發展密切相關，為腫瘤的無創性診斷開辟了一條新的途徑。并且，隨著分子生物學技術的發展，通過實時熒光定量PCR方法檢測尿液中微量的miRNAs已成為可能。所謂實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號的積累實時監測PCR的進程，最后通過標準曲線對待測模板進行定量分析。由于該技術操作簡便、敏感性高、重復性好，目前已在核苷酸檢測領域得到廣泛應用。 miRNA-155為癌基因BIC的表達產物，其在造血細胞分化、免疫、腫瘤及心血管等疾病各種生理或病理過程中起著重要的調控作用。2005年1rio應用微陣列芯片技術首次篩選出乳腺癌異常表達的miRNAs譜，發現miRNA-155是上調最明顯的miRNAs之一。Zhu等發現miRNA-155的表達水平較正常乳腺組織顯著上調，并且其與乳腺癌的TNM分期、淋巴結轉移、雌激素受體、孕激素受體呈明顯相關。近年來，隨著研究的不斷深入，發現miRNA-155在肺癌、胰腺癌、腎癌以及頭頸部腫瘤中表達均明顯升高，并且與腫瘤細胞的增殖、浸潤及轉移具有密切關系，表明miRNA有可能成為一種良好的腫瘤標志物分子。
技術實現思路
本專利技術的目的是為克服上述現有技術的不足，提供一種檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒及檢測方法，能夠快速、簡便、準確的檢測膀胱癌尿液中miRNA-155的表達量。為實現上述目的，本專利技術采用下述技術方案:一種檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物，包括:(I) miRNA-155的逆轉錄引物和檢測引物，逆轉錄引物的序列如SEQ ID N0:1所示，檢測引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miRNA-155-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’ ；miRNA-155-F:5’ -CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’ ；miRNA-155-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(2)miRNA-191的逆轉錄引物和檢測引物，逆轉錄引物的序列如SEQ ID NO:4所示，檢測引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:miRNA-191-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’ ；miRNA-191-F:5’ -GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’ ；miRNA-191-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(3)miRNA-16的逆轉錄引物和檢測引物，逆轉錄引物的序列如SEQ ID N0:7所示，檢測引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5’ -CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。一種檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒，包括上述引物，以及RNA分離液；所述RNA分離液由吐溫20、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水組成，其中，濃度如下:吐溫20:2.5% (體積百分數)，三羥甲基氨基甲烷:50mmol/L，乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1% (質量百分數)。所述檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒還包括PCR反應液，所述PCR反應液由IXSyber Green I熒光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成。優選的，各物質的濃度如下:DNA聚合酶:100U/mL ；dNTPs:0.2mM ;氯化鎂:6mM ;三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽:16.5mM ;氯化鉀:89.3mM。上述檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物在定量檢測膀胱癌miRNA-155表達量的應用。上述檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒在定量檢測膀胱癌miRNA-155表達量的應用。 一種檢測膀胱癌尿液miRNA-155表達量的方法，步驟如下:(I)分離尿液標本上清液，與等體積的RNA分離液混合，1600g離心5分鐘，之后16000g離心10分鐘，分離上清；(2) RT-PCR擴增:將上述分離的上清液進行反轉錄成cDNA，取cDNA為模板，加入引物和PCR反應液，進行PCR反應，檢測樣本閾值Cq (Test sample);同時以人膀胱癌細胞株T24細胞(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心)中提取miRNAs，逆轉錄成cDNA作為校對樣本，在每個PCR反應板中進行檢測，記錄Cq值；內參基因miRNA_191、miRNA-16的RT-PCR擴增，除引物采用相對應的逆轉錄引物和檢測引物外，方法相同；(3)制作標準曲線:上述檢測完成后，拷貝數以10為底取對數作為橫坐標，Cq值為縱坐標作圖，繪制標準曲線，計算斜率S，然后根據公式E=IO (_vs)-l，計算擴增效率E ;(4)計算:選中樣本和校對樣本檢測孔，應用實時熒光定量PCR儀的隨機軟件得出樣本閾值Cq (T)和校對樣本閾值Cq (C)，根據公式Q= (E+1)_Ag% A Cq=[Cq (T)-Cq (C)],得出基因的校正起始拷貝數Q ;將miRNA-155的Q值與內參基因miRNA_191、miRNA_16的Q值的幾何平均數相比，得到miRNA-155的相對表達量。本專利技術的有益效果是，本專利技術建立的膀胱癌尿液miRNA-155檢測方法，為膀胱癌的早期發現、早期治療提供了重要的參考依據。本專利技術利用本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測膀胱癌尿液miRNA?155的專用引物，其特征在于，包括：（1）miRNA?155的逆轉錄引物和檢測引物，逆轉錄引物的序列如SEQ?ID?NO：1所示，檢測引物的序列如SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3所示：miRNA?155?RT：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT?3’；miRNA?155?F：5’?CGCCTTAATGCTAATCGTGAT?3’；miRNA?155?R：5’?GTGCAGGGTCCGAGGT?3’；（2）miRNA?191的逆轉錄引物和檢測引物，逆轉錄引物的序列如SEQ?ID?NO：4所示，檢測引物的序列如SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6所示：miRNA?191?RT：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG?3’；miRNA?191?F：5’?GCCAACGGAATCCCAAAAG?3’；miRNA?191?R：5’?GTGCAGGGTCCGAGGT?3’；（3）miRNA?16的逆轉錄引物和檢測引物，逆轉錄引物的序列如SEQ?ID?NO：7所示，檢測引物的序列如SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9所示：miRNA?16?RT：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA?3’；miRNA?16?F：5’?CGCCTAGCAGCACGTAAATA?3’；miRNA?16?R：5’?GTGCAGGGTCCGAGGT?3’。...
【技術特征摘要】
1.一種檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物，其特征在于，包括: (1)miRNA-155的逆轉錄引物和檢測引物，逆轉錄引物的序列如SEQID N0:1所示，檢測引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miRNA-155-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’ ；miRNA-155-F:5’ -CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’ ；miRNA-155-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ； (2)miRNA-191的逆轉錄引物和檢測引物，逆轉錄引物的序列如SEQID N0:4所示，檢測引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:miRNA-191-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’ ；miRNA-191-F:5’ -GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’ ；miRNA-191-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ； (3)miRNA-16的逆轉錄引物和檢測引物，逆轉錄引物的序列如SEQID NO:7所示，檢測引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5’ -CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。2.一種 檢測膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的專用引物，以及RNA分離液；所述RNA分離液由吐溫20、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水組成，其中，濃度如下:吐溫20:2.5%，三羥甲基氨基甲烷:50mmol/L，乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1%。3.根據權...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王傳新，張欣，劉益民，
申請(專利權)人：山東大學齊魯醫院，
類型：發明
國別省市：
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