一種用于檢測肝癌的引物組及檢測方法技術

本發明專利技術提供用于檢測肝癌的引物組及其檢測方法，本發明專利技術的引物包括SEQ?ID?No.1??SEQ?ID?No.34，可對AFP、GPC3、AFU、GOLPH2、IGF?II、EpCAM、hTERT等17個基因進行聯合檢測。通過PCR或熒光定量PCR的方法，可在短時間內靈敏檢測出靶基因的表達及表達水平；采用優化的PCR條件，通過增加擴增反應的循環數，使觀察結果更顯著，進一步提高方法適用性；擴增產物具有特異性，確保PCR和熒光定量PCR檢測高準確度和靈敏度。實施本發明專利技術中用于肝癌檢測的引物組，通過檢測病人樣本中靶基因的表達，可以簡單、方便且準確地診斷肝癌。

【技術實現步驟摘要】
一種用于檢測肝癌的引物組及檢測方法
本專利技術涉及腫瘤基因領域，具體涉及一種用于檢測肝癌的引物組及檢測方法。
技術介紹
肝癌是世界上第五大最常見的惡性腫瘤，肝細胞癌是肝臟惡性腫瘤中最重要的病理類型，也在腫瘤相關的死亡原因中排名第三，從發現癥狀到死亡，患者生存時間不超過1年。肝癌的高病死率主要有兩個原因，其一是肝癌只有發展到較晚階段時才會出現臨床癥狀，其二是晚期肝癌缺乏有效的治療手段。因此，在大部分情況下，肝癌確診時已經錯過了最佳治療時間。肝癌主要發生于亞洲等地區的發展中國家，具有較典型的地理區域分布特點。近幾十年中，在美國和歐洲的發達國家中，肝癌的發病率也有很大的提高。據估計，在未來的20年中，肝癌的發病率和病死率將再增加1倍。到目前為止，盡管多種對于腫瘤的治療措施可用于降低腫瘤相關的病死率，但是在包括英國和美國等很多發達國家中，肝癌的病死率仍然沒有顯著的降低。為了克服這個巨大的挑戰，當前醫學研究的焦點集中于怎樣對肝癌進行早期診斷，以便于肝癌的及時治療.目前肝癌的診斷方法包括影像學檢查，細胞病理學和組織病理學診斷。影像學檢查包括CT掃描、核磁共振檢查等，但是其效率較低并且檢測準確度不高。通常的細胞和組織病理學檢測包括細胞活檢，需要通過外科手術或者穿刺的方法從患者上獲取腫瘤組織的檢材。不但不方便，而且會對患者造成人體傷害。近來，循環腫瘤細胞(CirculatingTumorCells，CTCs)檢測的出現給患者的檢測帶來了新的希望。CTCs是從腫瘤病灶脫離并移位至血液中的腫瘤細胞，是惡性腫瘤患者術后復發和遠處轉移的重要原因，也是導致腫瘤患者死亡的重要因素。與其他組織學標本如骨髓等相比，外周血標本容易獲取，且對患者創傷小，是臨床上常規檢測較為理想的標本來源。CTCs檢測有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預后、評估抗腫瘤藥物的療效及制定個體化治療方案。與傳統的診斷方法相比，CTCs檢測可更加敏感地發現疾病的變化，且對患者沒有副作用。CTC的檢測通常通過抽取一定體積的血液進行。檢測分為兩類，包括不捕獲(富集)直接檢測和先捕獲(富集)后檢測，其中后者為主流的檢測方法。先捕獲(富集)后檢測的方法也分為兩類，即正選和負選。正選主要是通過CTC表面標志物或細胞的物理性質(大小、密度)進行捕獲；前者是基于免疫磁球技術和微流控芯片技術，后者是基于過濾、離心的原理。負選則是通過白細胞表面標志物間接捕獲CTC。然而基于先捕獲(富集)后檢測的方法有著明顯的缺陷。它嚴重依賴于腫瘤細胞表面標記物的表達，因此無法捕獲未表達表面腫瘤標記物的CTC細胞。采用RT-PCR的方法檢測CTC細胞的特異性基因是CTC細胞檢測的另外一種方式。首先抽取一定體積的血液，通過密度梯度離心的方式富集CTCs，然后通過RT-PCR的方式檢測特定基因的mRNA，以此判斷CTCs是否存在，并通過檢測CT值的變化給CTCs定量。這種方法檢測CTCs費用低，敏感度高，而且容易自動化。目前RT-PCR方法檢測肝癌的CTCs檢測的標準還沒有建立。我們通過檢測肝癌患者的CTCs特征基因，確定肝癌CTCs的檢測方法和檢測標準。這些檢測方法和標準的建立有助于腫瘤患者的早期診斷、判斷患者預后、評估抗腫瘤藥物(包括NK和CAR-T免疫治療)的療效及制定個體化治療方案。針對上述問題，本專利技術開發一種高靈敏的多基因聯合檢測的試劑盒，通過聯合檢測AFP、GPC3、AFU、GOLPH2、IGF-II、EpCAM、hTERT、MAGE1、MAGE3、CD90、CD133、CK19、CD10、ASGPR、CPS1、HER2、FolateReceptor17個基因實現腫瘤的早期篩查或診斷。本專利技術設計運用靶向特異性引物組，大幅度提高檢測的靈敏度。該檢測方法的檢出率可達到98％，同時具備了靈敏度高，特異性好，快速準確等優點。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有技術的不足，提供一種用于檢測肝癌的引物組及檢測方法。本專利技術的目的是通過以下技術方案實現的，一種用于檢測肝癌的引物組，包含：本專利技術的引物組可通過以下兩種方法實現肝癌的檢測。方法1：PCR方法。(1)將權利要求1所述的17對引物分別加入到單個PCR反應管中，并均加入核酸提取物、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反應的每個循環的條件為94攝氏度、30s；55攝氏度、30s；72攝氏度、10s；(2)進行反轉錄和PCR反應，用瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。方法2：熒光定量PCR方法(1)將權利要求1所述的17對引物分別加入到單個PCR反應管中，并均加入核酸提取物、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；分別加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反應的每個循環的條件為95攝氏度、10s和60攝氏度、30s；40個循環；每管設立三個復孔；(2)進行反轉錄和PCR反應，并實時檢測熒光；(3)根據熒光檢測結果計算出的Ct值，判斷是否有標志物靶基因表達于樣品中。本專利技術的有益效果在于：本專利技術通過設計特異性PCR引物，開發出用于肝癌早期檢測的多基因聯合檢測方法。此方法：(1)建立的PCR體系可對AFP、GPC3、AFU、GOLPH2、IGF-II、EpCAM、hTERT、MAGE1、MAGE3、CD90、CD133、CK19、CD10、ASGPR、CPS1、HER2、folatereceptor基因進行聯合檢測；(2)通過同時對多個基因進行檢測肝癌檢出率可達到98％；(3)靈敏度高，低至1-5拷貝的基因表達水平均可檢出；(4)特異性強，正常人或非肝癌病人樣本不會產生非特異性信號；(5)檢測速度快，操作簡單，費用低廉。附圖說明圖1為實施例中健康人外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖2為實施例中非肝癌患者外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖3為實施例中非肝癌患者癌組織樣本檢測陰性PCR圖。圖4為實施例中肝癌患者外周血檢測陽性PCR圖。圖5為實施例中肝癌患者肝癌組織檢測陽性PCR圖。圖中，M.100bpmarker；1.AFP、2.GPC3、3.AFU、4.GOLPH2、5.IGF-II、6.EpCAM、7.hTERT、8.MAGE1、9.MAGE3、10.CD90、11.CD133、12.CK19、13.CD10、14.ASGPR、15.CPS1、16.HER2、17.FolateReceptor。具體實施方式本專利技術針對目前腫瘤中主要的驅動性突變基因，聯合檢測AFP、GPC3、AFU、GOLPH2、IGF-II、EpCAM、hTERT、MAGE1、MAGE3、CD90、CD133、CK19、CD10、ASGPR、CPS1、HER2、FolateReceptor17個基因實現肝癌的早期篩查或診斷。針對目前檢測方法靈敏度低，檢測過程復雜繁瑣，檢測所需時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。針對上述問題，設計出用于檢測上述17個基因的一整套特異性引物組。根據上述17個基因的參考序列設計特異性擴增引物，其PCR產物長度最優是在180-200b之間，退火溫度不高于60度，GC含量在40-60％之間，符合一般引物設計軟件的要求。通過采用實時熒光PCR反應檢測體系，實現多個基因聯合的高靈敏檢測，其檢測方法如下所述。本專利技術結合附圖和本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測肝癌的引物組，其特征在于，所述引物組可以包含a～q?17對引物，所述引物a的正向引物如SEQ?ID?No.1所示，引物a的反向引物如SEQ?ID?No.2所示，引物b的正向引物如SEQ?ID?No.3所示，引物b的反向引物如SEQ?ID?No.4所示，引物c的正向引物如SEQ?ID?No.5所示，引物c的反向引物如SEQ?ID?No.6所示，引物d的正向引物如SEQ?ID?No.7所示，引物d的反向引物如SEQ?ID?No.8所示，引物e的正向引物如SEQ?ID?No.9所示，引物e的反向引物如SEQ?ID?No.10所示，引物f的正向引物如SEQ?ID?No.11所示，引物f的反向引物如SEQ?ID?No.12所示，引物g的正向引物如SEQ?ID?No.13所示，引物g的反向引物如SEQ?ID?No.14所示，引物h的正向引物如SEQ?ID?No.15所示，引物h的反向引物如SEQ?ID?No.16所示，引物i的正向引物如SEQ?ID?No.17所示，引物i的反向引物如SEQ?ID?No.18所示，引物，j的正向引物如SEQ?ID?No.19所示，引物j的反向引物如SEQ?ID?No.20所示，所示引物k的正向引物如SEQ?ID?No.21所示，引物k的反向引物如SEQ?ID?No.22所示，所示引物l的正向引物如SEQ?ID?No.23所示，引物l的反向引物如SEQ?ID?No.24所示，所示引物m的正向引物如SEQ?ID?No.25所示，引物m的反向引物如SEQ?ID?No.26所示，所示引物n的正向引物如SEQ?ID?No.27所示，引物n的反向引物如SEQ?ID?No.28所示，所示引物o的正向引物如SEQ?ID?No.29所示，引物o的反向引物如SEQ?ID?No.30所示，所示引物p的正向引物如SEQ?ID?No.31所示，引物p的反向引物如SEQ?ID?No.32所示，所示引物q的正向引物如SEQ?ID?No.33所示，引物q的反向引物如SEQ?ID?No.34所示。...

【技術特征摘要】
1.一種用于檢測肝癌的引物組，其特征在于，所述引物組可以包含a～q17對引物，所述引物a的正向引物如SEQIDNo.1所示，引物a的反向引物如SEQIDNo.2所示，引物b的正向引物如SEQIDNo.3所示，引物b的反向引物如SEQIDNo.4所示，引物c的正向引物如SEQIDNo.5所示，引物c的反向引物如SEQIDNo.6所示，引物d的正向引物如SEQIDNo.7所示，引物d的反向引物如SEQIDNo.8所示，引物e的正向引物如SEQIDNo.9所示，引物e的反向引物如SEQIDNo.10所示，引物f的正向引物如SEQIDNo.11所示，引物f的反向引物如SEQIDNo.12所示，引物g的正向引物如SEQIDNo.13所示，引物g的反向引物如SEQIDNo.14所示，引物h的正向引物如SEQIDNo.15所示，引物h的反向引物如SEQIDNo.16所示，引物i的正向引物如SEQIDNo.17所示，引物i的反向引物如SEQIDNo.18所示，引物，j的正向引物如SEQIDNo.19所示，引物j的反向引物如SEQIDNo.20所示，所示引物k的正向引物如SEQIDNo.21所示，引物k的反向引物如SEQIDNo.22所示，所示引物l的正向引物如SEQIDNo.23所示，引物l的反向引物如SEQIDNo.24所示，所示引物m的正向引物如SEQIDNo.25所示，引物m的反向引物如SEQIDNo.2...

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐以兵，傅青春，洪德飛，孫倍成，王國勝，陶然，朱珍芳，
申請(專利權)人：浙江大學，中國人民解放軍第八五醫院，浙江省人民醫院，南京醫科大學第一附屬醫院，上海博慷生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江,33