一組檢測尤文氏肉瘤相關基因EWSR1斷裂分離的核酸探針制造技術

本發明專利技術屬于分子生物學領域，涉及一組檢測尤文氏肉瘤相關基因EWSR1斷裂分離的核酸檢測探針。使用該探針以熒光原位雜交技術檢測人組織切片樣本，可以快速的、特異性的檢測出尤文氏肉瘤相關基因EWSR1基因的斷裂分離情況，從而為尤文氏肉瘤的臨床診斷提供輔助判斷依據。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及腫瘤相關基因檢測
，更具體涉及尤文氏肉瘤(Ewing, ssamoma)相關基因斷裂分離檢測
，特別是涉及一組尤文氏肉瘤基因EWSRl斷裂分離的檢測探針。
技術介紹
尤文氏肉瘤(Ewing' s samoma),是骨科少見的一種惡性腫瘤,屬于一種高度惡性的小圓細胞原發腫瘤。在青少年骨腫瘤發病率中占第二位。是人體骨組織第三位易發的惡性腫瘤。1921年Ewing首先描述此原發惡性骨腫瘤。當時取名為“骨的彌漫性血管內皮瘤”。其后0berling(1928年)認為其起源于骨髓網狀細胞，稱之為“網狀肉瘤”。但很久以來，人們對其組織發生意見不統一，文獻中一直以姓氏命名。目前尤文肉瘤已被公認是一種獨立的骨腫瘤，但對其來源和性質仍存在有不同的意見，如間充質細胞、成骨細胞，但大多數研究者傾向于認為尤文氏肉瘤為神經外胚層細胞起源。現在研究表明，骨外尤文氏肉瘤(extraosseous Ewin g' s sarcoma, E0E)、外周原始神經外胚層瘤(pPNET)和兒童Askin' s瘤(胸壁PNET)等同屬于尤文氏腫瘤家族(Ewing' s sarcoma family of tumor,ESFr)，其具有不同程度的神經外胚層分化，是一組發生于軟組織的小圓細胞肉瘤，是軟組織小圓細胞腫瘤的代表類型。尤文氏肉瘤是軟組織腫瘤中第一個確定具有特征性染色體異位并產生融合性基因的腫瘤。在骨外尤文氏肉瘤中存在t(ll ；22) (q24 ;ql2)，產生EWSR1-FLI1融合基因，在外周原始神經外胚層瘤和發生于兒童肺部的Askin瘤中也存在相同的遺傳學異常，提示這三種病變在遺傳學上具有相同的基礎性異常，現這三種腫瘤已統稱為EWSRl/pPNET家族。研究顯示90% 95%的病例存在t (11 ；22) (q24 ;ql2)，導致llq24上的FLIl基因與22ql2上的EWSRl基因融合，產生EWSRl (5，端7號外顯子)-FLIl (3，端，6號外顯子I型，或5號外顯子II型)融合性基因。EWS是一種廣泛表達的功能性RNA結合蛋白。EWS基因的功能尚待闡明。FLIl基因是ETS原癌家族的一員，含有DNA結合域。正常情況下，FLIl在造血細胞中表達。在器官模型中，FLIl參與早期造血、血管和神經外胚層的發育。EffSRl-FLIl使EWSRl的N末端反式激活域與FLIl的C末端DNA結合域融合，融合蛋白起著轉錄促進子的作用，或者抑制靶基因，如EWSR1-FLI1負調節TGF-BII (TGFBR2)型受體，后者為一潛在的腫瘤抑制基因產物。TGFBR2受到抑制，可使瘤細胞能夠避免凋亡。在軟組織腫瘤中，有些腫瘤在細胞形態學上和EWSRl/pPNET家族有相似的小圓細胞，常常容易導致誤診。如轉移性神經母細胞瘤、分化差的腺泡狀橫紋肌肉瘤、促結締組織增生性小圓細胞腫瘤等。檢測EWSRl基因的斷裂分離可以排除這些腫瘤的干擾，準確鑒另1J、診斷尤文氏肉瘤(SalvatoreRomeo&AngeloP.DeiTos, Soft tissue tumors associatedwith EffSRl translocation, Virchows Arch(2010)456:219-234 DOI 10.1007/s00428-009-0854-3.)。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種用于檢測EWSRl基因斷裂分離的核酸探針組合。本專利技術的目的是通過下列技術方案實現的:一種用于診斷尤文肉瘤EWSRl基因斷裂分離的探針組合，該組合為BAC克隆片段CTD-2260D14, CTD-2050C22，CTD-3036013, RP11-155B12。其中 CTD-2260D14，CTD-2050C22定位于EWSRl基因著絲粒一側，核酸序列分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，標記相同的任意一種顏色的熒光，如標記綠色熒光；CTD-3036013，RP11-155B12定位于EWSRl基因端粒一側，核酸序列分別為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，標記相同但與著絲粒一側標記不同顏色的熒光，如標記紅色熒光；標記的熒光顏色可以互換。使用該探針組合檢測EWSRl基因斷裂分離的步驟如下:(a)樣本預處理:將組織切片樣本在二甲苯中脫蠟5分鐘，再重復I次。然后在95%、85%和70%乙醇中各水化2次，每次5分鐘。(b)雜交預處理:將樣本在95°C水中水浴15分鐘，取出樣本用胃蛋白酶消化15-20分鐘。轉移到2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分鐘。取出樣本用預冷的75%、85%和95%梯度乙醇脫水5分鐘，自然干燥。(c)樣本雜交:將探針加到預處理后的樣本玻片上，封片。置于雜交儀中82°C變性5分鐘，42 °C雜交過夜。(d)洗脫:移去蓋玻片，樣本用含SSC和NP-40的洗滌液洗脫2次，每次2分鐘。用75%、85%和95%梯度乙醇各脫水5分鐘，自然干燥。用DAPI覆蓋樣本，復染20分鐘。(e)鏡檢:在熒光顯微鏡下觀察，選擇藍色、綠色濾鏡分別觀察綠色、紅色信號，利用雙通道濾鏡觀察紅綠融合信號。選擇背景好，雜交信號強，細胞核大小均一的區域拍照和ο ο(f)結果判定:正常細胞染色體，可見兩個正常融合信號(或紅綠緊鄰)；在異常細胞染色體，可見一個正常的融合信號(或紅綠緊鄰)，一對紅/綠分離異常信號。當異常信號大于5%時記為陽性。本專利技術的有益效果在于:本專利技術的尤文肉瘤EWSRl基因斷裂分離FISH檢測方法通過對尤文肉瘤組織進行常規處理，然后采用雙色斷裂分離探針進行熒光原位雜交，根據檢測到的熒光信號判斷是否存在所述EWSRl基因的斷裂分離，設計巧妙，操作簡單，特異性和敏感性均有大幅提高，可以快速、準確、直觀檢測出尤文肉瘤EWSRl基因斷裂分離，檢測結果準確可靠，可為診斷尤文肉瘤作參考依據。適于大規模推廣應用。附圖說明圖1和圖2顯示了陰性檢測結果，可見兩個正常融合信號(或紅綠緊鄰)。圖3和圖4顯示了陽性檢測結果，在異常細胞染色體，可見一個正常的融合信號(或紅綠緊鄰)。具體實施方式 本專利技術中，EWSRl基因著絲粒一側BAC克隆片段為CTD-2260D14、CTD-2050C22，長度265kb，端粒一側BAC克隆為CTD-3036013、RP11-155B12，長度377kb。這些片段為細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome, BAC)克隆,其在人類染色體上的定位已經公開。選擇在EWSRl基因每端連接2個標記不同顏色的熒光的BAC克隆片段是為了增強熒光強度及范圍。通過試驗觀察，2個BAC克隆片段的熒光強度及范圍已經足夠觀察，可避免采用多個BAC克隆片段會導致熒光范圍分散而產生干擾，還可避免只采用I個BAC克隆片段可能出現熒光強度不夠的情形。克隆片段購自Invitrogen公司。探針標記:BAC克隆CTD-2260D14，CTD-2050C22采用FITC標記，生產綠色信號。BAC 克隆 CTD-3036013，RP11-155B12 采用 Tetramethyl-rhodamine 標記，產生紅色信號。將兩種探針，加上雜交緩沖液(含硫酸葡聚糖、去離子甲酰胺和SSC)、人類Co本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一組檢測尤文氏肉瘤相關基因EWSR1的斷裂分離的核酸檢測探針，其特征在于該組探針根據NCBI中GeneBank編號為NM_001163286的EWSR1基因核苷酸序列篩選設計。

【技術特征摘要】
1.一組檢測尤文氏肉瘤相關基因EWSRl的斷裂分離的核酸檢測探針，其特征在于該組探針根據NCBI中GeneBank編號為NM_001163286的EWSRl基因核苷酸序列篩選設計。2.根據權利要求1所述的核酸檢測探針，其特征在于探針為BAC克隆片段CTD-2260D14 和 CTD-2050C22，CTD-3036013 和 RP11-155B12，其核苷酸序列分別為 SEQ IDNO:1 和 SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4。3.根據權利要求2所述的核酸檢測探...

【專利技術屬性】
技術研發人員：不公告發明人，
申請(專利權)人：康盈創新生物技術北京有限公司，
類型：發明
國別省市：