本發明專利技術涉及一種檢測有關辣椒辣度基因的試劑盒及其檢測方法；具體含有如下引物：pun1A、pun1B、pun1C；pun12F、pun12R；pun13D、pun13E、pun13F；本發明專利技術使用特殊設計的引物，擴增提取到的辣椒基因組DNA中的Pun1、pun1突變、pun12突變和pun13突變的基因片段，能夠實現其快速檢測有關辣度相關基因，即通過上面的鑒定Pun1基因不同基因型的方法，就可以篩選出合適的親本，預防辣椒的辣度隨種植時間的推移而逐漸下降，避免品種退化及發展優良品種。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及準確檢測有關辣椒辣度的基因，具體涉及一種檢測有關辣椒辣度基因的試劑盒及其應用。
技術介紹
辣椒中辣味的主要成分是辣椒堿(capsaicin)。辣椒堿最早由Thresh在1876年從辣椒果實中分離出來并命名，如今在食品工業中作為添加劑和醫藥工業中作為抗菌、抗腫瘤和鎮痛藥物而被廣泛使用。同時它還可用作防污漆添加劑、生物農藥以及制造催淚彈和警用防衛武器等。其用途廣泛，備受重視。此外，辣椒堿含量也是評估辣椒一類果實品質的指標之一。1.辣味基因的鑒定 辣椒堿(capsaicin),在分類學上看,只能在爺科辣椒屬QCapsicum)植物的果實中，特別是其中的子房隔膜(placental dissepiment)中通過生物合成獲得。早期的遺傳學研究認為，辣椒辣味的產生是由單一顯性基因C (Punl)控制的，在純合隱性基因c (punl)作用下表現為辣味缺失，并且該基因對所有其他的辣味相關基因具有上位作用。Tanksley等最先找到了一個與C基因連鎖的分子標記⑶35，但遺傳距離大于10 CM。Ben等最先C基因位點定位于辣椒的第2號染色體上。后 來，Blum等以甜椒品種Maor {Capsicum annimm、與高辣辣椒BG2816 {Capsicum frutescens)為條本，構建了包含242個單株的F2群體,通過RFLP標記方法，遺傳作圖證實C基因位于第2號染色體上，并首次獲得了與C基因緊密連鎖的3個RFLP標記和I個離C基因位點僅0.4 CM的CAPS標記。隨后，Blum等在前期構建的F2群體基礎上，利用BSA法篩選到3個在不辣基因池與辣味基因池之間表現多態性的RAPD標記位點，通過成功轉換成SCAR標記后，將其中的一個主效QTL位點cap定位于辣椒的第7號染色體上，實驗證明該QTL位點可解釋在不同生境條件下表型變異的34% 38%。Lee等在一年生辣椒annuum)中分離到一個與Cr基因共分離的辣椒素合成酶基因(Capsaicin Synthase，^，序列分析表明甜椒的G基因5’上游區域存在一段2529 bp堿基缺失。Ben-Chaim等以微辣辣椒品種NuMex RNaky (,Capsicum與高辣品種BG2814-6//YZie1Scefl1S)為親本,構建了包含396個單株的F2群體及相應的F3群體，同時構建了包括SSR、AFLP、RFLP共728個標記的分子圖譜，找到了 6個與辣椒素類物質含量相關的QTL位點，并分別定位于第3、4和7號染色體上。分析表明，辣椒素類物質含量表型變化主要貢獻(24% 42%)來自于主效QTL位點cap7.1和定位于2號染色體無主效作用的標記(NP0326)間的二基因作用，而QTL位點cap7.2很可能是Blum等證實的對辣椒素類物質含量有顯著影響的QTL位點cap。Stewart等在C cAifleflse辣椒中發現了一個Punl基因的等位基因位點，并命名為punl2。序列分析發現punl2位點存在4個堿基缺失，導致編碼的蛋白質發生移碼突變(frameshift)，最終導致辣椒辣味的散失。王巖等通過同源克隆法，從不同基因型辣椒中克隆了 C基因的全長，序列比對分析證實，甜椒C基因5’端約689 bp的堿基缺失可能是造成其辣味散失的原因。最近，Stellari等(2010)又在另一個辣椒種Capsicum frutescens中發現了新的等位基因位點punl3,實驗證明punl3轉錄本的缺失與辣椒辣味的散失相關。Wyatt等在前人研究基礎上發展了一套標記，用以區別不同辣椒種中Punl、punl、punl2和punl3基因型，這些標記的獲得為辣椒種質資源的鑒定與辣椒育種提供了很好的參考。 2.Punl基因的不同突變類型 2.1 punl punl型突變會形成一個約2.5kb的片斷缺失，導致Punl基因的啟動子和大部分的外顯子I (exonl)的缺失，最終阻止Punl基因轉錄和表達。見圖4。 2.2 punl2· punl2型突變是移碼突變，由位于exonl中的4個bp的堿基缺失造成，該突變基因可以被轉錄，但不會形成相應的蛋白產物。見圖5。 2.3 punl3 punl3型突變會造成Punl基因3’端大段的基因缺失，該突變基因不會被表達轉錄。見圖6。 3.保持辣椒辣度的原理 辣椒的辣度跟其中所含辣椒堿的量成正比。目前已知的影響辣椒果實中辣椒堿合成的基因只有Punl基因。因此一旦該基因產生突變，就會極大地影響辣椒堿的合成和積累，造成辣椒的辣度逐代下降。在辣椒基因組中含有兩條Punl基因等位基因，根據孟德爾的等位基因分離規律，如果親本的辣椒為野生型Punl/Punl純合體，則子代的辣椒都為Punl/Punl基因型，其辣度會長時間的保持下去。如果親本辣椒基因型為Punl/punl (或punl2、punl3)雜合子，則其子I代會形成Punl/Punl、Pun I/pun I和punl/punl這三種基因型，比例為1:2:1，子2代三種基因型的比例大致為1:3:1?？梢钥闯?，對保持辣椒辣度最為有利的Punl/Punl基因型純合子的比例會逐代下降，從而導致辣椒的辣度逐漸下降。而如果親本辣椒的基因型為punl/punl突變型純合子，則后代基本不會有辣度。綜上所述，如果需要長久保持辣椒的辣度，則需要其親本都為野生型純合子。因此對現有的辣椒對其中的PunUpunl突變、punl2突變和punl3突變的基因進行檢測，能夠實現其快速檢測辣度，即通過上面的鑒定Punl基因不同基因型的方法，就可以篩選出合適的親本，預防辣椒的辣度隨種植時間的推移而逐漸下降。
技術實現思路
專利技術目的: 本專利技術提供一種試劑盒，該試劑盒可以快速和準確檢測有關辣度的基因。技術方案 一種檢測有關辣椒辣度基因的試劑盒，其特征在于含有如下引物:punl A:5’ ATTCTTGATCATCCTCATGCATC 3’punl B:5’ CACAAATTTTGTCCGATCTCAAC 3’punl C:5’ TTTGTTGCTTGTGCAACATCACC 3’punl2F:5’ AAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTC 3’punl2R:5’ CACCTTCAATCCCAAATTAATGTC 3’punl3 D:5’ TTGGGATTGAAGGTGGCAGAAG 3’punl3 E:5’ GAAGAAGGCATTCTTGGAGGG 3，punl3 F:5’ TCATGTCCATTCGGCCAAACAGTG 3’ 。所述的引物的濃度為10 μ Μ，各個引物體積為0.25 μ L 作為進一步說明:所述的一種檢測辣椒辣度的試劑盒包括PCR緩沖溶液IOx PCRbuffer(100 mM Tris-HCl, pH 8.8,500 mM KCl,15 mM MgCl2,0.8% [v/v] Nonidet P40),2.5 μ L ；2.5 mM dNTPs, I μ L ；Taq polymerase 0.25 μ L ； , 10 μ L ;;引物(10 μ M):punl突變:punl A, punl B, punl C各0.25 μ L ;punl2突變:punl2 F, p本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測有關辣椒辣度基因的試劑盒，其特征在于含有如下引物：pun1?A：5“?ATTCTTGATCATCCTCATGCATC?3“???pun1?B：5“?CACAAATTTTGTCCGATCTCAAC?3“???????pun1?C：5“?TTTGTTGCTTGTGCAACATCACC?3“pun12?F：5“?AAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTC?3“pun12?R：5“?CACCTTCAATCCCAAATTAATGTC?3“????pun13?D：5“?TTGGGATTGAAGGTGGCAGAAG?3“?????pun13?E：5“?GAAGAAGGCATTCTTGGAGGG?3“pun13?F：5“?TCATGTCCATTCGGCCAAACAGTG?3“?。
【技術特征摘要】
1.一種檢測有關辣椒辣度基因的試劑盒，其特征在于含有如下引物: punI A:5’ ATTCTTGATCATCCTCATGCATC 3’punI B:5’ CACAAATTTTGTCCGATCTCAAC 3’punI C:5’ TTTGTTGCTTGTGCAACATCACC 3’punI2 F:5’ AAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTC 3’punI2 R:5’ CACCTTCAATCCCAAATTAATGTC 3’punI3 D:5’ TTGGGATTGAAGGTGGCAGAAG 3’punI3 E:5’ GAAGAAGGCATTCTTGGAGGG 3，punI3 F:5’ TCATGTCCATTCGGCCAAACAGTG 3’ 。2.根據權利要求1所述的一種檢測有關辣椒辣度基因的試劑盒，其特征包括PCR緩沖液 IOx PCR buffer 2.5 μ L, 2.5 mM dNTPs, I μ L ;聚合酶 Taq polymerase 0.25 μ L, 20ng/yL 基因組 DNA，引物為 10 μ MjpH2O 至 25 yL； 其中 IOx PCR buffer 為含有 100 mM Tris-HCl, pH 8.8,500 mM KCl，15 mM MgCl2,0.8% v/v Nonidet P40 的混合物；引物:punl A, pun I B, pun I C 各 0.25 μ L ；punl2 F, punl2 R 各 0.25 μ L ；punl3 D, punl3 Ε, punl3 F 各...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李永忠，滕凌，張娟，路易斯伊格納羅，葉亞東，朱文華，王潤華，全利，潘鸝，胡娟，肖慧，葉汝章，楊紫俊，張俊，霍世元，
申請(專利權)人：常州亞當生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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