本申請(qǐng)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及ATP7B基因突變檢測(cè)引物組、試劑盒、其檢測(cè)方法及應(yīng)用，本發(fā)明專利技術(shù)的引物組涉及到ATP7B基因的大部分區(qū)域，包括外顯子和內(nèi)含子，能較為全面獲取患者的ATP7B基因的核苷酸序列情況，明確突變位點(diǎn)；且該引物組針對(duì)長(zhǎng)片段擴(kuò)增，在合適條件下擴(kuò)增出的條帶單一，無(wú)非特異性條帶，且由于擴(kuò)增片段長(zhǎng)，與短片段擴(kuò)增方法相比測(cè)序結(jié)果更為均勻，數(shù)據(jù)分析更為簡(jiǎn)單。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請(qǐng)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及ATP7B基因突變檢測(cè)引物組、試劑盒、其檢測(cè)方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
肝豆?fàn)詈俗冃裕址QWilson Disease(WD)，是一種具有不同發(fā)病年齡和不同臨床表型的嚴(yán)重的常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙疾病。國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，期患病率為1.5-3.0/10萬(wàn)，基因頻率為0.3-0.7％。在中國(guó)漢族人群中的攜帶率為1/50。肝豆?fàn)詈俗冃宰畛Ｒ?jiàn)的臨床表現(xiàn)為肝硬化、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和精神癥狀。肝豆?fàn)詈俗冃灾饕峭ㄟ^(guò)臨床表現(xiàn)如肝臟或/和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、家族史、角膜色素環(huán)、生化檢查包括檢測(cè)血清銅藍(lán)蛋白、24小時(shí)尿銅以及基因突變分析等來(lái)確診。肝豆?fàn)詈俗冃允悄壳斑z傳性疾病中治療效果較好的，早期診斷并給予控制銅攝入和排銅治療，對(duì)患者的治療效果具有積極和重要的意義。然而，由于該病在臨床表現(xiàn)的多樣性，容易出現(xiàn)誤診漏診，錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間，對(duì)病人造成不同程度的不可逆損害。ATP7B(ATPase Cu2+transporting beta polypeptide，β多肽銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶)是肝豆?fàn)詈俗冃灾虏』颍ㄎ挥?3q14.3，全長(zhǎng)78826bp，包括21個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子，它編碼一個(gè)P型銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶。ATP7B基因包括14個(gè)功能域：6個(gè)銅離子結(jié)合區(qū)、4個(gè)跨膜功能區(qū)、1個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)、1個(gè)離子通道及磷酸化區(qū)、1個(gè)核酸結(jié)合域和1個(gè)三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合區(qū)。目前，已知ATP7B基因突變超過(guò)500種，突變類型包括缺失突變、插入突變、移碼突變、錯(cuò)義突變和剪接突變等，其中點(diǎn)突變，尤其是錯(cuò)義突變最為常見(jiàn)。突變分為雜合突變和純合突變兩種突變形式，其中雜合突變更為常見(jiàn)。絕大多數(shù)突變位點(diǎn)均位于外顯子上，多位于跨膜
區(qū)及ATP功能區(qū)，也有少數(shù)突變點(diǎn)位于外顯子/內(nèi)含子交界側(cè)翼區(qū)中。因此對(duì)ATP7B外顯子以外的其他區(qū)域進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)于明確診斷具有重要的意義。近年來(lái)快速發(fā)展的高通量二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)是在基于第一代測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上被廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷與攜帶者篩查。二代測(cè)序由模板制備和序列檢測(cè)過(guò)程以及數(shù)據(jù)分析過(guò)程兩部分組成。其中，在技術(shù)上以邊合成邊測(cè)序?yàn)楹诵模ㄟ^(guò)大規(guī)模平行測(cè)序的手段，同時(shí)對(duì)數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的短DNA片段測(cè)序，獲得海量的序列信息，然后利用生物信息學(xué)工具進(jìn)行分析。Nature Methods雜志在2014年點(diǎn)評(píng)了過(guò)去十年對(duì)生物學(xué)研究影響最深的十大技術(shù)，二代測(cè)序居首位。二代測(cè)序的策略包括全基因組、外顯子組、目標(biāo)區(qū)域、表達(dá)譜、甲基化、染色體免疫共沉淀測(cè)序等。其中，目標(biāo)區(qū)域重測(cè)序是指針對(duì)感興趣的目標(biāo)區(qū)域或基因，通過(guò)靶區(qū)域捕獲或擴(kuò)增的方法富集，然后進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序。與全基因組、全外顯子組測(cè)序方法相比，目標(biāo)區(qū)域重測(cè)序能大規(guī)模、低成本篩查特定疾病的已知致病位點(diǎn)，在臨床診斷方面有著巨大的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本申請(qǐng)主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種ATP7B基因突變檢測(cè)引物組、試劑盒、其檢測(cè)方法及應(yīng)用，能夠準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)ATP7B基因突變。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)實(shí)施例采用的第一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種用于檢測(cè)ATP7B基因突變的引物組，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其不同之處在于，該引物組包括用于在PCR中擴(kuò)增ATP7B基因多個(gè)長(zhǎng)片段的檢測(cè)引物對(duì)，該引物組包括選自下列引物對(duì)中的至少5對(duì)、至少6對(duì)、至少7對(duì)、至少8對(duì)、至少9對(duì)、或全部10對(duì)引物：序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的引物對(duì)。其中，所述PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1min；每個(gè)循環(huán)98℃變性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30個(gè)循環(huán)；最后68℃孵育30min。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)實(shí)施例采用的第二個(gè)技術(shù)方案是：提供一種用于檢測(cè)ATP7B基因突變的試劑盒，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其不同之處在于，該試劑盒包括上述的引物組。其中，該試劑盒還包括以下一種或多種試劑:用于從樣品提取基因組DNA的試劑；利用所述引物組中的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)的試劑；用于處理PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以使擴(kuò)增產(chǎn)物能夠進(jìn)行高通量測(cè)序的試劑；以及用于對(duì)處理后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序的試劑。其中，所述高通量測(cè)序?yàn)镮on Torrent測(cè)序。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)實(shí)施例采用的第三個(gè)技術(shù)方案是：提供一種ATP7B基因突變的檢測(cè)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其不同之處在于，該方法包括如下步驟：獲得樣品的基因組DNA；利用上述的任一種引物組或上述的任一種試劑盒的每對(duì)引物對(duì)分別對(duì)所得基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將每對(duì)引物對(duì)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，對(duì)混合后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)
行基因型分析以確定基因突變情況。或者，一種ATP7B基因突變的檢測(cè)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其不同之處在于，該方法包括如下步驟：獲得樣品的基因組DNA；利用上述的任一種引物組或上述的任一種試劑盒的每對(duì)引物對(duì)分別對(duì)所得基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將每對(duì)引物對(duì)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，對(duì)混合后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序；對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，確定ATP7B基因突變情況。其中，所述PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1min；每個(gè)循環(huán)98℃變性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30個(gè)循環(huán)；最后68℃孵育30min。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)實(shí)施例采用的第四個(gè)技術(shù)方案是：提供一種利用上述的任一種引物組或上述的任一種試劑盒在ATP7B基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)實(shí)施例采用的第五個(gè)技術(shù)方案是：提供一種利用上述的任一種引物組或上述的任一種試劑盒在肝豆?fàn)詈俗冃院Y查中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的有益效果在于：本專利技術(shù)的引物組涉及到ATP7B基因的大部分區(qū)域，包括外顯子和內(nèi)含子，能較為全面獲取患者的ATP7B基因的核苷酸序列情況，明確突變位點(diǎn)；且該引物組針對(duì)長(zhǎng)片段擴(kuò)增，在合適條件下擴(kuò)增出的條帶單一，無(wú)非特異性條帶，且由于擴(kuò)增片段長(zhǎng)，與短片段擴(kuò)增方法相比測(cè)序結(jié)果更為均勻，數(shù)據(jù)分析更為簡(jiǎn)單；本專利技術(shù)的試劑盒及檢測(cè)方法采用長(zhǎng)片段DNA擴(kuò)增方法結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)的方式，具有高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高、低成本的優(yōu)勢(shì)。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本申請(qǐng)實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。顯而易見(jiàn)地，下面所描述的附圖僅僅是本申請(qǐng)的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本專利技術(shù)實(shí)施例1中家系成員ATP7B基因上家系譜圖。具體實(shí)施例為了使本申請(qǐng)的目的、本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測(cè)ATP7B基因突變的引物組，其特征在于，該引物組包括用于在PCR中擴(kuò)增ATP7B基因多個(gè)長(zhǎng)片段的檢測(cè)引物對(duì)，該引物組包括選自下列引物對(duì)中的至少5對(duì)、至少6對(duì)、至少7對(duì)、至少8對(duì)、至少9對(duì)、或全部10對(duì)引物：序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的引物對(duì)；序列如SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示的引物對(duì)；序列如SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6所示的引物對(duì)；序列如SEQ?ID?NO：7和SEQ?ID?NO：8所示的引物對(duì)；序列如SEQ?ID?NO：9和SEQ?ID?NO：10所示的引物對(duì)；序列如SEQ?ID?NO：11和SEQ?ID?NO：12所示的引物對(duì)；序列如SEQ?ID?NO：13和SEQ?ID?NO：14所示的引物對(duì)；序列如SEQ?ID?NO：15和SEQ?ID?NO：16所示的引物對(duì)；序列如SEQ?ID?NO：17和SEQ?ID?NO：18所示的引物對(duì)；序列如SEQ?ID?NO：19和SEQ?ID?NO：20所示的引物對(duì)。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測(cè)ATP7B基因突變的引物組，其特征在于，該引物組包括用于在PCR中擴(kuò)增ATP7B基因多個(gè)長(zhǎng)片段的檢測(cè)引物對(duì)，該引物組包括選自下列引物對(duì)中的至少5對(duì)、至少6對(duì)、至少7對(duì)、至少8對(duì)、至少9對(duì)、或全部10對(duì)引物：序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的引物對(duì)；序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的引物對(duì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)ATP7B基因突變的引物組，其特征在于，所述PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1min；每個(gè)循環(huán)98℃變性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30個(gè)循環(huán)；最后68℃孵育30min。3.一種用于檢測(cè)ATP7B基因突變的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括權(quán)利要求1或2的引物組。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)ATP7B基因突變的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括以下一種或多種試劑:用于從樣品提...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：洪文旭，段永恒，鄭開(kāi)封，林圣，曾序春，段山，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：深圳市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東;44
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