基因重組TNF-α衍生物RMP16及其制備方法與應用技術

本發明專利技術公開一種基因重組TNF-α衍生物RMP16及其制備方法與應用。通過基因重組得到的RMP16，與天然TNF-α相比，在血液中具有更高的穩定性和生理活性，可顯著抑制前列腺癌Du145、淋巴瘤Raji、白血病K562、宮頸癌HeLa、乳腺癌MCF-7等腫瘤細胞的生長，對DU145的抑制效果尤為突出，且可抑制顯著Du145細胞移植瘤的生長，其藥效學作用與雌莫司汀相似，Du145細胞移植瘤裸鼠，結果顯示，重組多肽RMP16的毒副作用明顯小于雌莫司汀，無明顯的毒副作用表現。該基因重組TNF-α衍生物RMP16可應用于制備具有如下功能的藥物：治療前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤。

【技術實現步驟摘要】
基因重組TNF-α衍生物RMP16及其制備方法與應用
本專利技術屬于基因工程
，特別涉及一種基因重組TNF-α衍生物RMP16及其制備方法與應用。
技術介紹
TNF-α是較早發現的、研究最為深入的腫瘤壞死因子家族成員之一，抗腫瘤作用強，參與多種生理病理過程的調節。人TNF-α為單拷貝基因，定位在第六號染色體上(6P12-13)，與MHC基因群緊密連鎖；TNF-α的cDNA大小約2.76kb，由4個外顯子和3個內含子組成。人TNF-α前體由233個氨基酸殘基組成，包括由第1、2號外顯子編碼的76個氨基酸殘基的信號肽；切除信號肽后形成非糖基化的成熟的人TNF-α，為157個氨基酸殘基，相對分子量為17kDa.。其中第69位和101位為兩個半胱氨酸，可形成分子內二硫鍵，對維持其空間結構有重要意義。TNF-α作為一種蛋白類因子，其生物學活性主要是通過和細胞膜上特異受體結合實現的。TNF-α有兩種受體，一種是存在于大部分細胞表面的分子量為55-60kDa.的腫瘤壞死因子受體Ⅰ(tumornecrosisfactorreceptorⅠ，TNFRⅠ)，另一種是主要存在于造血細胞表面的分子量為75-80kDa.的腫瘤壞死因子受體Ⅱ(tumornecrosisfactorreceptorⅡ，TNFRⅡ)。兩類TNFR均為跨膜糖蛋白，氨基酸序列分析顯示這兩種受體的胞外結構域的序列高度相似，都有保守的富含半胱氨酸的同源氨基酸序列；但是胞內結構域卻差異很大，TNFRⅠ胞內段含有死亡結構域(deathdomain，DD)，而TNFRⅡ沒有DD。TNFRⅠ在大多數種類細胞的表面都表達，且大部分生物學功能是由TNFRⅠ介導，包括殺細胞、抗病毒、誘導ICAM-1及IL-6的表達、促進成纖維細胞增殖、激活NF-κB等。TNFRII主要傳遞胸腺細胞和NK細胞等淋巴細胞的增殖信號，通過促進TNF-α與TNFRⅠ結合而增加TNFRⅠ誘導的作用。根據細胞及其微環境的不同，激活TNFRⅠ后可通過激活不同的信號途徑介導細胞增殖、凋亡、壞死性凋亡等程序。TNF-α具有很好抗腫瘤作用，被認為是最具潛質的癌癥治療藥物。但TNF-α在體內易被腎快速排泄和被各種蛋白酶分解，很不穩定，半衰期較短(15-30min)。若希望達到療效，則必須頻繁注射大劑量TNF-α，進而導致嚴重的不良反應，甚至引起休克死亡。TNF-α的上述缺陷，嚴重限制了其實際臨床應用，研究表明，小分子多肽具有分子量小、活性高、副作用小、無免疫原性、結構簡單、易于穿透腫瘤細胞等特點，已成為腫瘤藥物研發的新熱點。這些都預示著小分子TNF-α衍生物在臨床方面將有良好的應用前景。設計高穩定性、高生物活性的TNF-α衍生物，特別是能與血漿中的載體蛋白結合的小分子TNF-α衍生物，可提高其生物利用度，發揮天然TNF-α抗腫瘤的同時，也極大降低了天然TNF-α具有的副作用。具有重要的藥用價值和產業化前景。
技術實現思路
為了克服現有技術的缺點與不足，本專利技術的首要目的在于提供一種基因重組TNF-α衍生物RMP16。該衍生物RMP16具有更高穩定性和更高生物活性。本專利技術的另一目的在于提供所述基因重組TNF-α衍生物RMP16的制備方法。該制備方法根據TNF-α衍生物RMP16的氨基酸序列及大腸桿菌密碼子的偏好性，設計RMP16在原核表達系統的基因序列，采用基因工程技術，結合蛋白內含肽(intein)的可誘導剪切功能實現目的多肽RMP16的高效制備；該制備方法生產效率高，生產成本低。本專利技術的再一目的在于提供所述基因重組TNF-α衍生物RMP16的應用。本專利技術的目的通過下述技術方案實現：一種基因重組TNF-α衍生物RMP16，其氨基酸序列如下所示：MWQRPSSWIEGRLLTHTISRIAVSYQTKVNLL。編碼所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列為：ATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTGCTGACCCATACCATTAGCCGCATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAATCTGCTG；所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的制備方法，包括以下步驟：(1)設計并合成RMP16基因：采用3條引物兩步法合成RMP16基因：引物F1：5'-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3'；引物F2：5'-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3'；引物F3：5'-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3'；其中，CATATG為NdeⅠ酶切位點，GCTCTTCCGCA為SapⅠ酶切位點；GGTGGT和CCACCAT為保護堿基；首先將引物F1和引物F2進行鏈延伸反應，然后以其產物為DNA模板，以F1和F3為引物，PCR反應制得RMP16基因；(2)構建重組載體pTXB1-RMP16：用Ndel酶和Sapl酶分別對質粒pTXB1和步驟(1)制得的RMP16基因進行雙酶切，再將雙酶切后的RMP16基因和雙酶切后的質粒pTXB1連接，得到重組載體pTXB1-RMP16；(3)制備表達工程菌pTXB1-RMP16/ER2566：用重組載體pTXB1-RMP16轉化表達宿主菌大腸桿菌E.coliStrainER2566，得到表達工程菌pTXB1-RMP16/ER2566；(4)表達和純化：①誘導表達工程菌pTXB1-RMP16L/ER2566表達由目的多肽、蛋白內含肽和幾丁質結合域(Chitinbindingdomain，CBD)組成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質柱進行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質柱中，然后含有β-巰基乙醇的溶液過柱并充滿幾丁質柱環境中，反應；β-巰基乙醇的作用是誘導蛋白內含肽的N端切割，釋放目的多肽；然后用洗脫幾丁質柱的溶液洗柱，收集洗脫液；③利用高效液相色譜技術純化目的多肽，得到基因重組TNF-α衍生物RMP16。步驟(1)中所述的鏈延伸反應的條件優選為：94℃，10min；60℃，5min；72℃，10min；步驟(1)中所述的PCR反應的條件優選為：94℃，5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，31次循環；72℃延伸10min；步驟(4)②中所述的含有β-巰基乙醇的溶液的組成如下：20mMTris-HCI，0.5MNaCl，1mMEDTA，50mMβ-巰基乙醇，pH8.0；步驟(4)②中所述的反應的條件優選為23℃反應24小時；步驟(4)②中所述的洗脫幾丁質柱的溶液的組成優選如下：20mMTris-HCl，500mMNaCI，1mMEDTA，pH8.0；步驟(4)③中所述的利用高效液相色譜技術純化目的多肽RMP16的步驟如下：A、流動相A為在體積百分比5％乙腈(CNCH3，溶質為純水)中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的終濃度為體積百分比0.1％；流動相B為100％乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的終濃度為體積百分比0.1％；流速1mL/min，30min線性梯度洗脫；B、線性本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基因重組TNF?α衍生物RMP16，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技術特征摘要】
1.一種基因重組TNF-α衍生物RMP16，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根據權利要求1所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16，其特征在于：編碼所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.權利要求1或2所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)設計并合成RMP16基因：采用3條引物兩步法合成RMP16基因：引物F1：5'-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3'；引物F2：5'-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3'；引物F3：5'-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3'；其中，CATATG為NdeⅠ酶切位點，GCTCTTCCGCA為SapⅠ酶切位點；GGTGGT和CCACCAT為保護堿基；首先將引物F1和引物F2進行鏈延伸反應，然后以其產物為DNA模板，以F1和F3為引物，PCR反應制得RMP16基因；(2)構建重組載體pTXB1-RMP16：用Ndel酶和Sapl酶分別對質粒pTXB1和步驟(1)制得的RMP16基因進行雙酶切，再將雙酶切后的RMP16基因和雙酶切后的質粒pTXB1連接，得到重組載體pTXB1-RMP16；(3)制備表達工程菌pTXB1-RMP16/ER2566：用重組載體pTXB1-RMP16轉化表達宿主菌大腸桿菌E.coliStrainER2566，得到表達工程菌pTXB1-RMP16/ER2566；(4)表達和純化：①誘導表達工程菌pTXB1-RMP16L/ER2566表達由目的多肽、蛋白內含肽和幾丁質結合域組成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質柱進行純化，“三元”融合...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬義，洪岸，姜石松，
申請(專利權)人：暨南大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44