本發明專利技術公開了一種MUC1和GM-CSF雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有MUC1基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MUC1基因；所述MUC1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。本發明專利技術所述的雙基因共表達重組載體，采用IRES序列來連接MUC1基因和GM-CSF基因，能夠在同一載體中同時表達人上皮粘蛋白以及粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子，該重組載體可用于腫瘤的基因免疫治療，既能發揮細胞因子的免疫調節作用，又能靶向性地產生特異性抗腫瘤效應。
【技術實現步驟摘要】
MUC1和GM-CSF雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用
本專利技術涉及一種重組載體及其制備方法和應用，特別是涉及一種雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用。
技術介紹
癌癥是世界嚴重的公共衛生問題，據國際癌癥研究機構公布的數據顯示，每年全球約800萬人死于癌癥。我國近20年來癌癥呈現年輕化及發病率和死亡率“三線”走高的趨勢。全國腫瘤登記中心發布的《2012中國腫瘤登記年報》顯示，每年新發腫瘤病例約為312萬例，平均每天8550人,全國每分鐘有6人被診斷為癌癥,全國腫瘤死亡率為180.54/10萬，每年因癌癥死亡病例達270萬例。腫瘤免疫治療技術以現代分子生物學、細胞生物學和分子免疫學等前沿科學為基礎，利用機體對腫瘤的免疫應答,通過生物手段改變腫瘤和機體之間的相互作用,調動機體對腫瘤的防御機制，達到控制腫瘤生長，提高患者生活質量，延長患者生存期的目的，是繼手術、放療、化療后第四種腫瘤治療模式，也是腫瘤綜合治療的重要組成部分。腫瘤免疫治療的目的，不僅要有效激活消除腫瘤細胞的免疫應答反應，還要建立起長遠的抗腫瘤記憶效應。腫瘤免疫治療包括兩個主要的策略:非特異性輔助免疫治療和抗原特異性免疫治療。非特異性輔助免疫治療，是通過調節系統或局部細胞因子或共刺激分子的濃度來刺激免疫系統。抗原特異性免疫治療，包括抗原的轉運、表達和呈遞，抗原激活的T細胞的遷移，以及采用抗原負載的DC細胞治療等。研究表明，通過載體表達腫瘤相關抗原并共表達細胞因子或共刺激分子，表現出相互協同促進的作用，有助于誘導抗原特異性T細胞免疫應答，從而表現出顯著的抗腫瘤活性。由此可見，要誘導強有力的抗腫瘤免疫應答，不僅需要腫瘤相關抗原的表達和呈遞，還需要增強共刺激分子和細胞因子介導的免疫作用。在多數研究中，抗腫瘤免疫應答的效果與共表達的免疫促進型細胞因子和共刺激分子的數目呈正相關。細胞因子基因免疫是目前腫瘤基因治療研究的熱點，將具有抗腫瘤作用的細胞因子基因導入宿主體內，并使之穩定有效地表達，使體內持續存在一定水平的內源性細胞因子，以發揮抗腫瘤的作用。然而，現有的細胞因子基因免疫治療方法只是提高機體免疫能力，增強共刺激分子和細胞因子介導的免疫作用，無法實現腫瘤相關抗原的表達和呈遞。粒細胞-巨卩遼細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophageColony StimulatingFactor, GM-CSF)是由活化的T細胞、B細胞、巨噬細胞、肥大細胞、內皮細胞以及成纖維細胞等產生并分泌的一種酸性糖蛋白。GM-CSF是一種重要的免疫調節劑，廣泛參與機體的造血、免疫及抗感染等過程，對感染性疾病的發生、發展有重要影響。GM-CSF作為目前已知功能最強大的免疫調節分子，在增強機體抗腫瘤免疫功能方面顯示了良好的應用前景，并被廣泛應用于腫瘤的免疫治療。GM-CSF可通過以下機制參與免疫調節:(I)提高腫瘤細胞MHC分子的表達；(2)誘導樹突狀細胞的成熟、分化并增強抗腫瘤體液免疫；(3)上調共刺激分子CD86表達，逆轉T淋巴細胞免疫耐受；(4)促進效應性T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)在腫瘤部位浸潤，殺傷腫瘤細胞。GM-CSF可作為化療的輔助用藥，提升腫瘤患者外周血白細胞水平(主要為粒細胞與單核細胞數量)的同時，誘導機體的免疫系統活化，加強對腫瘤的免疫。除上述生物學效應外，GM-CSF還能增加腫瘤基質分泌血管生成抑制素，抑制腫瘤的血管生成和轉移。GM-CSF的抗腫瘤作用受到廣泛共識，并已經正式開始運用于臨床腫瘤免疫治療。GM-CSF的基因治療及基因修飾的腫瘤細胞疫苗在研究中同樣顯示了抗腫瘤作用。GM-CSF以其顯著的免疫調節作用和低毒性成為腫瘤疫苗重要的免疫佐劑，轉染GM-CSF基因的腫瘤疫苗在傷口愈合、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等基礎和臨床研究中均取得了顯著效果。然而，目前的GM-CSF基因免疫治療方法只是局部地提高機體的GM-CSF蛋白表達水平，其免疫調節作用、抗腫瘤能力較小，而且缺乏免疫治療的靶向性。粘蛋白(Mucins，MUC)在正常人體內主要存在于胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道以及乳腺等多種上皮組織中，對正常的上皮起潤滑和保護作用，同時還介導信號轉導和細胞粘附。而在腫瘤組織中，MUC多出現異常表達，表現為量和質的改變，并且與腫瘤的浸潤、轉移及預后相關。人上皮黏蛋白(MUCl)是由MUCl基因表達的粘蛋白家族中的一種I型跨膜蛋白，其多肽骨架主要由胞外段、跨膜段和胞內段組成，胞外區由可變數目(20~125個)串聯重復序列(Variable Number Tandem Repeats, VNTR)組成,抗原表位即位于VNTR區。此種肽鏈表位在正常表達時，被外周糖鏈所掩蓋，不能被識別；在癌變時，由于糖基轉移酶活性增高導致不完全糖基化，不完全糖基化又導致側鏈變短及核心膚暴露，顯現出相關膚抗原表位、糖抗原表位，從而獲得免疫原性。MUCl已確定在多種腫瘤細胞中高表達，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、多發性骨髓瘤等。
技術實現思路
基于此，有必要針對現有技術存在的缺陷，提供一種MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體，該重組載體可用于腫瘤的基因免疫治療，既能發揮細胞因子的的免疫調節作用，又能靶向性地產生特異性抗腫瘤效應。本專利技術的另一個目的是，提供所述MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體的制備方法。本專利技術的再一個目的是，提供所述MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體在腫瘤的基因免疫治療中的應用。MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有MUCl基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MUCl基因；所述MUCl基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示。在其中一個實施例中，所述的載體為PIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為PIRES2-MUC1-GM-CSF重組載體；其中，MUCl基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。在其中一個實施例中，所述pIRES2-EGFP質粒載體中的EGFP序列被GM-CSF基因替代。本專利技術所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟:I)獲得含有特異性酶切位點的MUCl基因片段；2)將步驟I)得到的MUCl基因片段連接于載體，構建含有MUCl基因的重組載體； 3)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段；4)將步驟3)得到的GM-CSF基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構建所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體。在其中一個實施例中，所述的pIRES2-MUCl-GM-CSF重組載體的制備方法，包括以下步驟:a)獲得含有特異性酶切位點的MUCl基因片段:從乳腺癌細胞MCF-7獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點序列的MUCl特異性引物進行PCR擴增，得到含有Bgl II和EcoR I酶切位點的MUCl基因片段，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
MUC1和GM?CSF雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有MUC1基因、IRES序列和GM?CSF基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有GM?CSF基因、IRES序列和MUC1基因；所述MUC1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述GM?CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。
【技術特征摘要】
1.MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有MUCl基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MUCl基因; 所述MUCl基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。2.根據權利要求1所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體，其特征在于:所述的載體為PIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為pIRES2_MUCl-GM_CSF重組載體；其中，MUCl基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。3.根據權利要求2所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體，其特征在于:所述PIRES2-EGFP質粒載體中的EGFP序列被GM-CSF基因替代。4.權利要求1所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟: O獲得含有特異性酶切位點的MUCl基因片段； 2)將步驟I)得到的MUCl基因片段連接于載體，構建含有MUCl基因的重組載體； 3)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段； 4)將步驟3)得到的GM-CSF基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構建所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體。5.權利要求2所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟: a)獲得含有特異性酶切位點的MUCl基因片段:從乳腺癌細胞MCF-7獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點序列的MUCl特異性引物進行PCR擴增，得到含有BglII和EcoR I酶切位點的MUCl基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； b)構建pIRES2-MUCl-EGFP重組載體:用限制性內切酶BglI1、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質粒以及步驟a)得到的MUCl基因片段，并采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到pIRES2-MUCl-EGFP重組載體； c)獲得含有酶切粘性末端的GM-C...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曹毓琳，左百樂，栗炳南，連杰，林俊堂，豐慧根，
申請(專利權)人：河南省華隆生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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