本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種調(diào)控性CIAPIN1基因重組腺病毒及其制備方法和應(yīng)用，該重組腺病毒是將一個(gè)CIAPIN1基因表達(dá)盒插入復(fù)制缺陷5型腺病毒基因組中而得到，CIAPIN1基因表達(dá)盒由Survivin啟動(dòng)子、CIAPIN1基因和終止子組成，CIAPIN1基因的表達(dá)受Survivin啟動(dòng)子調(diào)控；該重組腺病毒具有較強(qiáng)的選擇性和特異性，通過腫瘤特異性Survivin啟動(dòng)子調(diào)控CIAPIN1基因的表達(dá)，能夠使CIAPIN1基因選擇性地表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，發(fā)揮抑制細(xì)胞克隆、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，在準(zhǔn)確殺傷神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的同時(shí)減少正常組織細(xì)胞的損傷，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示其能夠有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，延長荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率，因此，可用于制備神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療藥物，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因治療領(lǐng)域有著較好的開發(fā)應(yīng)用前景。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物基因工程領(lǐng)域，涉及一種基因重組腺病毒，特別涉及一種調(diào)控性 CiAPim基因重組腺病毒，還涉及該重組腺病毒的制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
神經(jīng)膠質(zhì)瘤是威脅人類健康的重要疾病，其治療新方法的研究一直是醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究的重點(diǎn)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物治療已被世界醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為是繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大治療方法，其中基因治療更是目前腫瘤生物治療中最活躍的研究領(lǐng)域之一。神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因治療的原理是將目的基因用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入靶細(xì)胞，使靶細(xì)胞表達(dá)此基因而獲得特定的功能，繼而執(zhí)行或介導(dǎo)對腫瘤的殺傷和抑制作用，從而達(dá)到治療之目的。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡抑制因子1 (cytokine induced apoptosis inhibitorl, CIAPIN1)是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)胞因子依賴性抗凋亡分子，并已經(jīng)被證實(shí)是獨(dú)立于凋亡調(diào)節(jié)分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的另一個(gè)調(diào)節(jié)分子。從目前的研究結(jié)果來看，一方面CIAPim在不同組織來源的惡性腫瘤中表達(dá)水平存在明顯差異，使得CIAPim在相應(yīng)腫瘤的發(fā)生過程及增殖凋亡過程中發(fā)揮的作用不同；另一方面CIAPIN1 參與了腫瘤多藥耐藥的發(fā)生及逆轉(zhuǎn)。因此，CIAPim基因的生物學(xué)功能仍未明了，內(nèi)源性和外源性CIAPim基因可能發(fā)揮不同的功能，CIAPim與腫瘤的發(fā)生可能與多基因、多因素有關(guān)。迄今為止，國內(nèi)外尚未見有關(guān)調(diào)控性CIAPim基因重組腺病毒及其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域應(yīng)用的研究報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術(shù)的目的之一在于提供一種調(diào)控性CIAPim基因重組腺病毒，通過腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控CIAPim基因的表達(dá)，使CIAPim基因能選擇性地表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，從而在準(zhǔn)確殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)減少正常組織細(xì)胞的損傷；目的之二在于提供所述調(diào)控性CiAPim基因重組腺病毒的制備方法；目的之三在于提供所述調(diào)控性CiAPim基因重組腺病毒在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案1、調(diào)控性CIAPim基因重組腺病毒，系將一個(gè)CIAPim基因表達(dá)盒插入復(fù)制缺陷5型腺病毒基因組中而得到，所述CIAPim基因表達(dá)盒由Survivin啟動(dòng)子、CIAPIN1基因和終止子組成，所述CIAPim基因的表達(dá)受Survivin啟動(dòng)子調(diào)控。2、調(diào)控性CIAPim基因重組腺病毒的制備方法，包括以下步驟a、Survivin啟動(dòng)子的克隆根據(jù)Survivin基因啟動(dòng)子片段的核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成引物，以神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增兩端分別帶有Bio I酶切位點(diǎn)和Nco I酶切位點(diǎn)的Survivin啟動(dòng)子片段，將其克隆入pGEM_T載體，得重組載體pGEM_T/ SurvivinP ；b、ciAPmi基因的克隆根據(jù)CiAPim基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成引物，將人胚胎腎293細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板，PCR擴(kuò)增兩端分別帶有Hind III 酶切位點(diǎn)和BamH I酶切位點(diǎn)的CIAPim全長cDNA，將其克隆入pMD18_T載體，得重組載體pMD18-T/CIAPim ；再自重組載體pMD18_T/CIAPmi中用Hind III和BamH I雙酶切出 CIAPim全長cDNA，與同樣經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)在 T4 DNA連接酶的作用下連接，得重組載體pcDNA3. 1-CIAPIN1 ；c、調(diào)控性CIAPim基因重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建自步驟a所得重組載體pGEM-T/ SurvivinP中用Xho I和Nco I雙酶切出Survivin啟動(dòng)子片段，與同樣經(jīng)Xho I和Nco I 雙酶切的步驟b所得重組載體pcDNA3. I-CIAPim在T4 DNA連接酶的作用下連接，得重組載體 pcDNA3. I-SurvivinP-CIAPINl ；再自重組載體 pcDNA3. I-SurvivinP-CIAPINl 中用 Xho I和BamH I雙酶切出SurvivinP-CIAPINl片段，與同樣經(jīng)Xho I和BamH I雙酶切的腺病毒穿梭載體PShuttle在T4 DNA連接酶的作用下連接，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-SurvivinP-CIAPINl ；d、調(diào)控性CIAPim基因重組腺病毒載體的構(gòu)建將步驟c所得重組腺病毒穿梭載體paiuttle-SurvivinP-CIAPim用Rne I酶切使線性化后，與腺病毒骨架載體 PAdEasy-I共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)同源重組，得重組腺病毒載體 pAd-SurvivinP-CIAPINl ；e、調(diào)控性CIAPim基因重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增和純化用脂質(zhì)體法將步驟d所得重組腺病毒載體pAd-SurvivinP-CIAPim轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，離心收集細(xì)胞，反復(fù)凍融使細(xì)胞裂解，離心去除細(xì)胞碎片，收集含病毒的上清液，得重組腺病毒 Ad-SurvivinP-CIAPINl原液；將病毒原液再感染293細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，所得含病毒上清液采用氯化銫梯度離心純化，即得調(diào)控性CIAPim基因重組腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPINl。進(jìn)一步，步驟a中所述引物序列為上游引物5，-gcctcgaggctcaagtgacaagcaagt gtttat-3，；下游弓丨物5，-gcccatgggggctcacctggctgctc-3，。進(jìn)一步，步驟a中所述PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性1 分鐘、58°C退火1分鐘，72°C延伸1. 5分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。進(jìn)一步，步驟b中所述引物序列為上游引物5，-gggaagcttatggcagattttgggatc t_3，；弓L 5' -atgggatccctagtacgcagtaagcggtc-3‘ 進(jìn)一步，步驟b中所述PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性30 秒、65 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。3、調(diào)控性CIAPim基因重組腺病毒在制備神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療藥物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的有益效果在于本專利技術(shù)的調(diào)控性CIAPim基因重組腺病毒具有較強(qiáng)的選擇性和特異性，通過腫瘤特異性Survivin啟動(dòng)子調(diào)控CIAPim基因的表達(dá)，能夠使CIAPIN1 基因選擇性地表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，發(fā)揮抑制細(xì)胞克隆、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，在準(zhǔn)確殺傷神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的同時(shí)減少正常組織細(xì)胞的損傷，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示其能夠有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，延長荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率，因此，可用于制備神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療藥物，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因治療領(lǐng)域有著較好的開發(fā)應(yīng)用前景。附圖說明圖1為Survivin啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為PCR產(chǎn)物。圖2為CIAPim基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 為PCR產(chǎn)物。圖3為感染本專利技術(shù)重組腺病毒的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞的凋亡率比較圖。圖4為感染本專利技術(shù)重組腺病毒的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞的克隆形成率比較圖。圖5為給予本專利技術(shù)重組腺病毒或PBS的荷瘤裸本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
１．調(diào)控性ＣＩＡＰＩＮ１基因重組腺病毒，其特征在于：將一個(gè)ＣＩＡＰＩＮ１基因表達(dá)盒插入復(fù)制缺陷５型腺病毒基因組中而得到，所述ＣＩＡＰＩＮ１基因表達(dá)盒由Ｓｕｒｖｉｖｉｎ啟動(dòng)子、ＣＩＡＰＩＮ１基因和終止子組成，所述ＣＩＡＰＩＮ１基因的表達(dá)受Ｓｕｒｖｉｖｉｎ啟動(dòng)子調(diào)控。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊曌，吳玉章，
申請(專利權(quán))人：中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：85
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