一種指導(dǎo)華法林用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種指導(dǎo)華法林用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法，包括超純水，X溶液，10×PCR緩沖液，PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對照品，特點是PCR引物包括5個與華法林用藥相關(guān)基因上的7個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內(nèi)參的正反向擴增引物及反應(yīng)內(nèi)參的正反向擴增引物，其基因序列如SEQ?ID?NO.1～NO.32所示；其檢測包括采集樣本并提取核酸的步驟；以提取的核酸為模板進行PCR反應(yīng)的步驟；最后GeXP遺傳分析儀毛細電泳分離樣品的步驟，優(yōu)點是特異性強、準(zhǔn)確性高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結(jié)果。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種多重基因檢測試劑盒及其檢測方法，尤其是涉及。
技術(shù)介紹
華法林為香豆素類口服抗凝藥，是臨床上常用的抗凝藥物，華法林通過抑制凝血因子的活化抑制新的血栓形成，限制血栓的擴大和延展，抑制在血栓的基礎(chǔ)上形成新的血栓，抑制血栓脫落和栓塞的發(fā)生，有利于血栓的清除。臨床上主要用于治療房顫、心瓣膜修復(fù)術(shù)、再發(fā)性的中風(fēng)、深靜脈血栓以及肺動脈栓塞。但是華法林治療窗窄、劑量個體差異大，在其治療的開始階段，大約有12%的患者發(fā)生出血性事件，其中2%發(fā)生致死性出血。研究表明，人群對華法林的個體差異與單核苷酸多態(tài)性(SNP)密切相關(guān)。其中華法林靶標(biāo)VKORCl(維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位I)和參與華法林代謝的CYP2C9 (細胞色素P450酶2C9)以及CYP4F2、CALU和GGCX等基因的遺傳多態(tài)性與患者的有效劑量和致出血劑量密切相關(guān)。對上述基因多態(tài)性的診斷能改善華法林抗凝的安全性，減少抗凝初期劑量滴定時間，以求盡快達到治療水平的INR (internationalnormalizedratio,國際標(biāo)準(zhǔn)化比值)?，F(xiàn)有的用于指導(dǎo)華法林用藥相關(guān)基因的診斷方法主要為基因芯片、熒光定量PCR。(I)基因芯片利用目標(biāo)DNA與支持物上所固 定的密集的寡核苷酸探針陣列進行等位基因特異性反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)后信號的有無和強弱確定SNP位點?；蛐酒扛?，但普遍準(zhǔn)確度不夠，易出現(xiàn)假陽性。(2)熒光定量PCR方法通過設(shè)計特異性的探針可以準(zhǔn)確得出樣品基因型，操作簡單、快速。但其通量較低，每次反應(yīng)僅能檢測單個位點，對于上述基因的相關(guān)SNP位點需要進行多個反應(yīng)的檢測，成本過高，不利于市場應(yīng)用。同時，目前的這些檢測方法僅局限于檢測VKORCl和CYP2C9兩個基因上的3至4個SNP位點，信息涵蓋面不夠，指導(dǎo)性不足。Gen0meLabTMGeXP多重基因表達遺傳分析系統(tǒng)基于貝克曼公司成熟的毛細管電泳分離技術(shù)及高靈敏度的激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)研發(fā)而成，一束8道的毛細管陳列設(shè)計充分利用了 96孔板的排列特性，降低了使用更大的陳列帶來的花費和復(fù)雜性。采用多重PCR方法，通過Beckman Coulter染色標(biāo)記,在同一個EP管中同時分析多個基因的的等位基因型,能快速有效地檢測基因的表達狀況，克服了上述方法存在的缺陷，具有以下優(yōu)點:1、高通量:本系統(tǒng)采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術(shù)，實現(xiàn)單個反應(yīng)檢測30-40個位點，可同時做192個反應(yīng)(如192個患者樣品，每個樣品檢測30種腹瀉病毒，30個位點)，一天出結(jié)果；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準(zhǔn)確報告，避免漏檢。2、準(zhǔn)確性強:GeXP采用毛細管電泳對PCR產(chǎn)物進行分離檢測，可將非特異性擴增產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴增產(chǎn)物分離，最大程度降低假陽性；3、敏感性高，結(jié)果重復(fù)性好:GeXP系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)PCR擴增方法的不均等擴增造成的偏差，提高了對一套目的基因進行定量的速度和敏感性，采用激光誘導(dǎo)熒光-PMT，具有超聞靈敏度；4、方法簡便，使用經(jīng)濟:GeXP提供從試劑、多重PCR引物設(shè)計、結(jié)果及定量表達譜分析等全套實驗方案；每個樣品的檢測成本少于￥50，利于大規(guī)模推廣；5、精確定量、靈活性強:可精確定量病原體基因拷貝數(shù)，可隨時根據(jù)需求調(diào)整檢測的靶基因。6、易于實現(xiàn)自動化:就樣品制備而言，Biomek系列自動液體處理儀可以與GeXP分析儀和Ampligrid擴增儀完全匹配，集成的條形碼閱讀器保證了準(zhǔn)確的樣品追蹤和結(jié)果報告目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統(tǒng)的指導(dǎo)華法林用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法的相關(guān)研究報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強、準(zhǔn)確度高、通量高、可靠性強、成本低、無假陰性結(jié)果的基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統(tǒng)的指導(dǎo)華法林用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法。本專利技術(shù)解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種指導(dǎo)華法林用藥的多重基因檢測試劑盒，包括超純水(ddH20)，X溶液，10XPCR緩沖液，PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對照品，所述的PCR引物包括以下5個與華法林用藥相關(guān)基因上的7個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內(nèi)參的正反向擴增引物及反應(yīng)內(nèi)參的正反向擴增引物，其核酸序列如下表I所示:表I本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種指導(dǎo)華法林用藥的多重基因檢測試劑盒，包括超純水，X溶液，10×PCR緩沖液，PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對照品，其特征在于所述的PCR引物包括以下5個與華法林用藥相關(guān)基因上的7個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內(nèi)參的正反向擴增引物及反應(yīng)內(nèi)參的正反向擴增引物，其基因序列如下表所示：

【技術(shù)特征摘要】
1.一種指導(dǎo)華法林用藥的多重基因檢測試劑盒，包括超純水，X溶液，IOXPCR緩沖液，PCR引物，25mM氯化鎂溶液，DNA聚合酶和陽性對照品，其特征在于所述的PCR引物包括以下5個與華法林用藥相關(guān)基因上的7個SNP位點上的不同基因型的正反向擴增引物、DNA內(nèi)參的正反向擴增引物及反應(yīng)內(nèi)參的正反向擴增引物，其基因序列如下表所示:2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種指導(dǎo)華法林用藥的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA ;反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標(biāo)記。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種指導(dǎo)華法林用藥的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述的陽性對照品為為上述5個與華法林用藥相關(guān)基因上的7個SNP位點上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。4.一種利用權(quán)利要求1-3中任一項所述的指導(dǎo)華法林用藥的多重基因檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)采集樣本并提取核酸 采集腫瘤患者口腔拭子或血液樣品的分離培養(yǎng)物，從分離培養(yǎng)物中提取核酸； (2)以提取的核酸為模板進行PCR反應(yīng) 取DNA樣品2 μ L，10 XPCR緩沖液2 μ L，25mM的...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：南麗，顏進，吳勇，
申請(專利權(quán))人：海爾施生物醫(yī)藥股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：