本發明專利技術公開了轉基因斑馬魚模型在篩選治療G6PD缺乏癥的藥物中的應用。該轉基因斑馬魚模型是由紅系細胞特異性啟動子gata1驅動118?144位點缺失的突變g6pd基因，同時也是表達EGFP的可示蹤的轉基因斑馬魚模型。該模型是通過顯性負效應建立的葡萄糖?6?磷酸脫氫酶缺乏癥（G6PDD）的斑馬魚模型用于篩選治療G6PD缺乏癥藥物的過程中能可示蹤的觀察到藥物處理過程中紅細胞的變化以實現其應用。本發明專利技術獲得了一種全新的篩選治療G6PD缺乏癥藥物的便利方式，提高了藥物篩選的效率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種轉基因斑馬魚模型在篩選治療G6PD缺乏癥的藥物中的應用，屬于基因工程
技術介紹
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥（gluocose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，簡稱G6PD 缺乏癥）俗稱蠶豆病，是世界上最常見的遺傳性溶血性紅細胞酶缺陷病。紅細胞在成熟的過程中喪失了細胞核和核糖體，因而不能合成蛋白質，無法進行三羧酸循環。因此成熟的紅細胞主要靠磷酸戊糖途徑來提供能量。G6PD是磷酸戊糖代謝途徑的限速酶。6-磷酸葡萄糖在G6PD的催化下產生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和5-磷酸核糖（ribose-5-phosphate，R5P）。NADPH對維持谷胱甘肽（glutathione,GSH）的還原狀態從而保護紅細胞免受氧化劑的損害極為重要。G6pd 基因突變導致G6PD 酶活性降低，會影響NADPH的產生。NADPH是機體多種物質合成代謝的供氫體，同時維持還原型谷胱甘肽（GSH 的還原狀態） 的生成量。NADPH缺乏會減弱機體抗氧化劑（還原型谷胱甘肽GSH、過氧化氫H2O2）的抗氧化效果，使紅細胞中的血紅蛋白及紅細胞膜在接觸氧化性損傷時受到損害及發生溶血。目前全世界就G6PD 缺乏癥發病的詳細機制尚不清楚，有待進一步的研究探討。常見臨床表現包括新生兒黃疸、藥物或感染造成的急性溶血、蠶豆病和先天性非球形細胞溶血性貧血（CNSHA）等。現今，對G6PD 缺乏癥的治療措施主要為早期篩查，避免誘發因素等預防治療措施。一旦經確診后的病例給予服禁用藥物，避免誘發因紊。高膽紅素血癥予以藍光照射、堿化血液、輸白蛋白、輸血等對癥治療，以及相關輔助治療。國內外仍未有特異性治療G6PD 缺乏癥的治療措施。Gata-1 是原始紅系發育中的特異性的啟動子，標記早期紅系細胞。在24hpf,斑馬魚的血液循環開始建立時可檢測到gata-1-egfp 標記的紅細胞隨循環流動。48h 之后gata-1 表達逐漸減少。所以利用gata-1 作為驅動突變的g6pd 基因的啟動子可以使突變型g6pd 基因在紅細胞中特異性表達。從而實現突變型g6pd基因在紅細胞中表達的“可示蹤”觀察。目前并沒有一種十分理想的動物實驗模型可以很好的實現g6pd 基因的結構變化與功能之間關系的研究。目前，世界已報道400多種G6PD缺乏生化型和160多種G6PD基因突變類型。G6PD基因突變具有以下特點：多為單個堿基置換的錯義突變，尚未發現整個基因或大片段基因的缺失，也未見無義突變及移碼突變。中國人群中至少鑒定出31種點突變。1388G-A、1376G-T、1024C-T、1004C-T、871G-A和95A-T為中國人最常見的g6pd基因突變類型，其累計基因頻率超過了86%。通過蛋白質比較，本課題組發現，人和斑馬魚的蛋白具有很高的相似性（相似度88%）。A95T是中國一個比較常見的突變位點，通過對蛋白質三維結構（PDB ID: 2BHL)的學習，發現在第32號氨基酸附近存在著以下二級結構：32-37號氨基酸是β折疊的區域，38-40號氨基酸是β轉角的區域，40號氨基酸是NADP+的結合位點，42-46號氨基酸是α螺旋的區域[19]。通過和人的G6PD蛋白序列的比對，擬敲除斑馬魚G6PD的第40-48位氨基酸，即對斑馬魚G6PD基因序列118-144位置制造突變，通過分子生物學技術將突變型g6pd基因裝入特定載體中，利用顯微注射技術將目的質粒導入斑馬魚體內，實現顯性負性效應，進而建立G6PD缺乏癥的斑馬魚模型，從而進一步研究斑馬魚中g6pd的突變對其G6PD酶活性的影響，G6PD的結構及功能的變化導致紅細胞受損的詳細機制。為人類G6PD缺乏癥的詳細機制及大規模高通量藥物篩選提供基礎。
技術實現思路
本專利技術要解決的主要技術問題是開發出由gata-1 啟動子驅動的118-144位點突變g6pd基因與egfp基因的轉基因斑馬魚模型，并提供該轉基因斑馬魚模型的建立方法及該轉基因斑馬魚模型在篩選治療G6PD缺乏癥藥物的過程中的應用。本專利技術首先提出了一種轉基因斑馬魚模型，該模型是由紅系細胞特異性啟動子gata1驅動118-144位點缺失的突變g6pd基因，同時也是表達EGFP的可示蹤的轉基因斑馬魚模型。這種由gata1啟動子驅動g6pd突變基因與egfp基因表達的轉基因斑馬魚模型的建立方法，包括以下步驟：1）將g6pdM118-144-egfp-PCS2+，gata-1-PBSK-Isce I質粒酶切連接構建了gata1-g6pdM118-144-egfp-PBSK-Isce I質粒。2）將gata1-g6pdM118-144-egfp-PBSK-Isce I質粒通過顯微注射的方式注入1細胞期斑馬魚胚胎動物極胚盤內。3）通過觀察24hpf期胚胎是否表達綠色熒光篩選出轉基因的胚胎并孵化養至成魚作為F0代轉基因斑馬魚。4）以F0代轉基因斑馬魚與野生型交配后產生的表達綠色熒光的胚胎孵化并養至成魚作為F1代轉基因斑馬魚。5）通過觀察胚胎EGFP熒光情況和基因組PCR 法鑒定轉入的g6pdM118-144-egfp基因的表達和插入情況。其中，步驟1）中的g6pd基因的突變位點是118-144位點，該位點是模擬人類G6PD缺乏癥中95A-T突變所產生的效應。進一步的，這種由gata-1 啟動子驅動g6pdM118-144突變基因和EGFP基因的轉基因斑馬魚模式的應用主要是：該模型是通過顯性負效應建立的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥（G6PDD）的斑馬魚模型用于篩選治療G6PD缺乏癥藥物的過程中能可示蹤的觀察到藥物處理過程中紅細胞的變化。相比于傳統的G6PD缺乏癥動物模型，本專利技術具有如下優點：1.gata-1是原始紅系發育中的特異性的轉錄因子，標記早期紅系細胞。在24hpf，斑馬魚的血液循環開始建立，利用gata-1 作為驅動突變的g6pd 基因的啟動子可以使突變型g6pd 基因在紅細胞中特異性表達。2.gata1同時驅動g6pd與egfp基因，可實現突變型g6pd基因在紅細胞中表達的“可示蹤”觀察。3.斑馬魚胚胎與成魚通體透明，構建的該動物模型可以在顯微鏡下示蹤胚胎和魚體內熒光標記紅細胞在藥物誘導下的變化規律，為篩選治療G6PD缺乏癥的藥物提供可視的動物模型。附圖說明圖1是gata1-g6pdM118-144-egfp轉基因斑馬魚胚胎F1代幼魚熒光表達鑒定情況。圖1中：A-E分別是zgata1:g6pdM118-144-egfp發育至11.24.36.48.72小時的熒光圖；F-J野生型斑馬魚對照；圖2是基因組PCR鑒定結果。圖2中：M:DNA mark 1.zgata1:g6pdM118-144-egfp 轉基因系斑馬魚；2.WT；3.zgata1-egfp ；4.空白；圖3是全胚胎原位雜交檢測egfp鑒定轉基因模型構建情況。圖3中：A.zgata1:g6pdM118-144-egfp 轉基因系斑馬魚；B.zgata1-egfp 轉基因系斑馬魚；C. WT斑馬魚。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本專利技術作進一步的詳細說明。實施例本文檔來自技高網...
【技術保護點】
轉基因斑馬魚模型在篩選治療G6PD缺乏癥的藥物中的應用。
【技術特征摘要】
1.轉基因斑馬魚模型在篩選治療G6PD缺乏癥的藥物中的應用。2.根據權利要求1所述的轉基因斑馬魚模型在篩選治療G6PD缺乏癥的藥物中的應用，其特征在于：該轉基因斑馬魚模型是由紅系細胞特異性啟動子gata1驅動118-144位點缺失的突變g6pd基因，同時也是表達EGFP的可示蹤的轉基...
【專利技術屬性】
技術研發人員：何志旭，舒莉萍，周艷華，夏海雄，宋錦，吳西軍，楊燕，
申請(專利權)人：貴州醫科大學，
類型：發明
國別省市：貴州;52
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