本發明專利技術公開一種重組人胰島素樣生長因子-2蛋白及其生產方法，表達宿主BL21（DE3），載體pET32-a(+)，步驟如下：克隆hIGF2基因；構建原核表達載體；可溶性的N端帶有His×6標記的Trx-hIGF2融合蛋白的表達；Trx-hIGF2融合蛋白的純化；利用帶His×6標記的腸激酶對Trx-hIGF2融合蛋白進行酶切，得高純度的hIGF2。本發明專利技術首次用BL21（DE3）和pET32-a(+)，實現hIGF2高效可溶性融合表達；用His×6標簽及腸激酶切割技術，實現在蛋白質一級結構上，與hIGF2完全相同的重組hIGF2蛋白的制備，表達產物也具有生物活性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及應用重組DNA技術生產基因工程蛋白藥物技術，具體來說，涉及一種。
技術介紹
胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)是一類多功能細胞增殖調控因子，因其化學結構與胰島素相似而得名。人胰島素樣生長因子-2 (Human InsulinLike Growth Factor-2, hIGF2)基因由9個外顯子、8個內含子組成,其轉錄與表達受到4個啟動子調控，為一單拷貝基因，全長3kb。成熟的人IGF2蛋白由67個氨基酸殘基組成，它 在胎兒發育、腫瘤細胞增殖、肌肉生長等方面具有重要的調控作用。IGF2與有促進有絲分裂 活性作用的胰島素具有結構上的同源性，業已證明，IGF2至少在嚙齒類動物中是促進有絲分裂的主要生長因子。體外細胞培養實驗也已證明，IGF2是肌細胞生長過程中的自分泌信號。IGF2是一種潛在的胎兒生長激素。IGF2的表達與個體發育密切相關，IGF2的缺乏與人類身材矮小相關，它們的過度表達與肢端肥大有關，IGF2還可調節脂肪細胞的生長，從而影響個體的脂肪與肌肉比例。除此之外，IGF2還在器官的形成和分化中發揮重要作用。IGF2作為調節多肽，與許多疾病的發生和發展密切相關，如一種先天性的疾病貝-威綜合癥就是因為IGF2過度表達引起的。IGF2也與許多腫瘤的發生密切相關。IGF2基因的LOI已經在橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、睪丸生殖細胞癌、乳腺癌及肺癌等20多種腫瘤中被發現，而且IGF2轉基因小鼠中這些腫瘤的發生率也明顯增高。這說明IGF2在腫瘤發生中可能有著十分重要的地位。近年來，多項研究已發現在結腸腫瘤及肝癌發生期間，IGF2mRNA的表達增強。IGF2的自分泌為某些細胞生長的初級方式，其旁分泌為廣泛基質腫瘤如乳腺癌生長的主要方式，尚未發現IGF2經自分泌調節的腫瘤。IGF2是目前生物、醫學領域研究的熱點，隨著其發生印跡機制的理解不斷演進，深入研究IGF2的遺傳學特征、表達機制及生物學意義，將有助于人類控制自身疾病，能為臨床診斷和治療帶來新思路。因此，IGF2重組蛋白極具開發價值。目前，主要利用大腸桿菌來生產重組人IGF2蛋白。而這些利用大腸桿菌來生產重組人IGF2蛋白的方法都有明顯的缺陷。大腸桿菌的人IGF2表達產物通常以包涵體形式存在，要通過變性復性等復雜操作才能得到活性形式的hIGF2，從而減少了活性蛋白的產率；若想得到可溶性的重組蛋白，往往采取以融合蛋白的形式進行表達，而將融合片段去除是一件非常繁瑣的工作，大大增加了生產的成本；最后，要得到高純度的蛋白往往需要經過多步純化操作處理，純化的步驟越多，蛋白質的得率就會越低，且可能導致目標產物的失活。
技術實現思路
基于此，本專利技術提供一種重組hIGF2蛋白及其高效表達、純化和制備方法，該方法首次利用重組載體pET32-a(+)和表達宿主大腸桿菌BL21 CodonPlus (DE3)菌株，實現了hIGF2的融合且可溶表達，并獲得了大量穩定、可溶且具有生物活性的hIGF2重組蛋白，該蛋白在一級結構上與天然人IGF2完全相同。利用鎳親合層析可以快速將蛋白從細胞裂解上清液中分離出來，獲得高純度的Trx-hIGF2融合蛋白。利用N端帶有His X 6標記的腸激酶對Trx-hIGF2融合蛋白進行酶切，經鎳親合層析，將未經切割的Trx_hIGF2融合蛋白、Trx-HisX6融合片段及加入的腸激酶吸附于層析柱上，而經切割的hIGF2重組蛋白存在于穿透液中，穿透液經超濾濃縮后得到高純度的產品。利用該方法得到的hIGF2重組蛋白，能刺激NIH/3T3的增殖并激活Akt信號通路的磷酸化，表明該方法制備的重組人IGF2具有很好的生物學活性。解決上述問題的技術方案如下一種Trx_hIGF2融合蛋白的生產方法，主要包括以下步驟(I)克隆hIGF2基因以人腎臟細胞中提取的總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該cDNA為模板，用特異引物擴增出完整hIGF2基因片段，所用hIGF2特異引物中引入BamH I酶切位點和HindIII酶切位點；回收PCR產物連接到質粒pMD20_T載體，得重組質粒hIGF2/pMD20-T，經過測序確定為讀碼框正確的重組載體；(2)構建原核表達載體將表達載體pET32_a(+)和步驟(I)所得的重組質粒hIGF2/pMD20-T經Hind III及BamH I雙酶切并純化回收，并用T4DNA連接酶連接，得重組載體pET32-a (+)/hIGF2，將重組載體轉化到大腸桿菌T0P10菌株中，再從T0P10中提取重組載體pET32-a (+) /hIGF2 ;用熱激法，將重組載體pET32_a (+) /hIGF2轉入到大腸桿菌表達菌株BL21CodonPlus (DE3)中，經LBAmp抗性平板篩選得到大腸桿菌重組轉化子；(3)Trx-hIGF2融合蛋白的表達將步驟(2)所得的大腸桿菌重組轉化子于37°C培養至OD6tltl為O. 55 — O. 65，加入O. 05 — I. OmM的IPTG，于溫度為20°C的條件下誘導5-7小時，超聲破碎，離心取上清液，得到大量表達的可溶性的N端帶有His X 6標記的Trx-hIGF2融合蛋白；(4) Trx-hIGF2融合蛋白的純化利用鎳親合層析法對步驟(3)所得的Trx_hIGF2融合蛋白進行純化。一種hIGF2重組蛋白的生產方法，主要包括以下步驟(I)克隆hIGF2基因以人腎臟細胞中提取的總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該cDNA為模板，用特異引物擴增出完整hIGF2基因片段，所用hIGF2特異引物中引入BamH I酶切位點和HindIII酶切位點；回收PCR產物連接到質粒pMD20_T載體，得重組質粒hIGF2/pMD20-T，經過測序確定為讀碼框正確的重組載體；(2)構建原核表達載體將表達載體pET32_a(+)和步驟(I)所得的重組質粒hIGF2/pMD20-T經Hind III及BamH I雙酶切并純化回收，并用T4DNA連接酶連接，得重組載體pET32-a (+)/hIGF2，將重組載體轉化到大腸桿菌T0P10菌株中，再從T0P10中提取重組載體pET32-a (+) /hIGF2 ;用熱激法，將重組載體pET32_a (+) /hIGF2轉入到大腸桿菌表達菌株BL21 CodonPlus (DE3)中，經LBAmp抗性平板篩選得到了大腸桿菌重組轉化子；(3)Trx-hIGF2融合蛋白的表達將步驟(2)所得的大腸桿菌重組轉化子于37°C培養至OD6tltl為O. 55 — O. 65，加入O. 05 — I. OmM的IPTG，于溫度為20°C的條件下誘導5-7小時，超聲破碎，離心取上清液，得到大量表達的可溶性的N端帶有His X 6標記的Trx-hIGF2融合蛋白；(4) Trx-hIGF2融合蛋白的純化利用鎳親合層析法對步驟(3)所得的Trx_hIGF2融合蛋白進行純化；(5)利用帶有HisX6標記的腸激酶對步驟(4)所得的Trx_hIGF2融合蛋白進行酶切，經鎳親合層析，未經切割的Trx-hIGF2融合蛋白、Trx-His X 6蛋白片段及加入的腸激酶吸附在鎳親合層析樹脂上，而經切割的不帶His本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種Trx？hIGF2融合蛋白的生產方法，其特征在于，主要包括以下步驟：（1）克隆hIGF2基因：以人腎臟細胞中提取的總mRNA為模板，先用RT？PCR擴增總cDNA，再以該cDNA為模板，用特異引物擴增出完整hIGF2基因片段，所用hIGF2特異引物中引入BamH？I酶切位點和HindIII酶切位點；回收PCR產物連接到質粒pMD20？T載體，得重組質粒hIGF2/pMD20？T，經過測序確定為讀碼框正確的重組載體；（2）構建原核表達載體：將表達載體pET32？a(+)和步驟（1）所得的重組質粒hIGF2/pMD20？T經Hind？III及BamH？I雙酶切并純化回收，并用T4DNA連接酶連接，得重組載體pET32？a(+)/hIGF2，將重組載體轉化到大腸桿菌TOP10菌株中，再從TOP10中提取重組載體pET32？a(+)/hIGF2；用熱激法，將重組載體pET32？a(+)/hIGF2轉入到大腸桿菌表達菌株BL21CodonPlus（DE3）中，經LBAmp抗性平板篩選得到大腸桿菌重組轉化子；（3）Trx？hIGF2融合蛋白的表達：將步驟（2）所得的大腸桿菌重組轉化子于37℃培養至OD600為0.55－0.65，加入0.05－1.0mM的IPTG，于溫度為20℃的條件下誘導5？7小時，超聲破碎，離心取上清液，得到大量表達的可溶性的N端帶有His×6標記的Trx？hIGF2融合蛋白；（4）Trx？hIGF2融合蛋白的純化：利用鎳親合層析法對步驟（3）所得的Trx？hIGF2融合蛋白進行純化。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳東海，李洪波，胡興，徐愛民，李鵬，金守光，李娜，
申請(專利權)人：中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院，
類型：發明
國別省市：
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