pUC19-TVG質(zhì)粒的構(gòu)建及使用方法技術(shù)

pUC19-TVG質(zhì)粒的構(gòu)建及使用方法。本發(fā)明專利技術(shù)的技術(shù)方案提供了一種新型的載體pUC19-TVG，其特征在于，所述載體是基于限制性內(nèi)切酶酶切及連接原理由載體pUC19改造而來(lái)，載體中含有包括EcoRI、MluI、NotI、XhoI、HindIII在內(nèi)的多克隆位點(diǎn)，不含Xho?I、Mlu?I、Sac?I、Kpn?I、Cla?I、EcoRV、NcoI、Pst?I、BglII、Sal?I、Pst?I、BamH?I、Sca?I、Xba?I酶切位點(diǎn)，因此該載體能夠?qū)崿F(xiàn)多基因片段依賴酶切位點(diǎn)的融合及單一基因的分段和拼接，同時(shí)該載體還可以用于解決長(zhǎng)片段基因克隆過(guò)程中極易出現(xiàn)的錯(cuò)配問(wèn)題。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物工程
，具體涉及一種能夠有效解決基于酶切位點(diǎn)基因融合問(wèn)題的新載體及其應(yīng)用示范。
技術(shù)介紹
pBR322質(zhì)粒是目前在基因克隆中廣泛使用的一種大腸桿菌質(zhì)粒載體。符號(hào)質(zhì)粒載體pBR322中的“P”代表質(zhì)粒；“BR”代表兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首； “322”是實(shí)驗(yàn)編號(hào)。PBR322是一個(gè)人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒，有萬(wàn)能質(zhì)粒之稱。在pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建過(guò)程中，一個(gè)重要目標(biāo)是縮小基因組的體積，移去一些對(duì)基因克隆載體無(wú)關(guān)緊要的DNA片段，限制酶識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)還要設(shè)法使質(zhì)粒同存在任何易位子統(tǒng)統(tǒng)失去功能。易位子的轉(zhuǎn)移(即易位)有可能導(dǎo)致選擇記號(hào)的喪失，甚至也有可能使克隆的DNA片段喪失或重排。PBR322質(zhì)粒是由來(lái)源于pBR322質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因(amp^，來(lái)源于pSClOl質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因(tef)和來(lái)源于ColEl的派生質(zhì)粒Pmbl的DNA復(fù)制起點(diǎn)(ori)三部分組成。質(zhì)粒載體PBR322的大小為4361bp，相對(duì)分子質(zhì)量較小的是它第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)之二是它帶有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，保證了該質(zhì)粒只在大腸桿菌的細(xì)胞中行使復(fù)制的功能。具有兩種抗生素抗性基因——氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，可供轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記是它的第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)。質(zhì)粒載體PBR322的第四個(gè)優(yōu)點(diǎn)是具有較高的拷貝數(shù)， 經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增以后，每個(gè)細(xì)胞中可累積1000-3000份拷貝，該特性為重組體DNA的制備提供了極大的方便。pUC載體是在pBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5'-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的IacZ'基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。一種典型的PUC系列的質(zhì)粒載體，包括來(lái)自PBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ori)、氨芐青霉素抗性基因 (an^)，但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來(lái)的核酸內(nèi)切限制酶的單識(shí)別位點(diǎn)、大腸桿菌β-半乳糖酶基因(IacZ)的啟動(dòng)子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為IacZ'基因和位于IacZ'基因中的靠近5'-端的一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能。PUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)是(I)具有更小的分 子量和更高的拷貝數(shù)， 如pUC8為2750bP，pUC18為2686bP。(2)適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來(lái)自大腸桿菌Iac操縱子的=IacZ'基因，所編碼的α _肽鏈可參與互補(bǔ)作用。(3)具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段pUC8質(zhì)粒載體具有與M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點(diǎn) MCS區(qū)段，它可以在這兩類載體系列之間來(lái)回“穿梭”。PUC19載體是pUC載體系列中極具代表性一種質(zhì)粒，適合于DNA片段的克隆、進(jìn)行DNA測(cè)序、對(duì)外源基因進(jìn)行表達(dá)等。雖然PUC19 載體已被國(guó)內(nèi)外研究工作者廣泛使用，但鑒于其功能單一，目前已逐步被其他載體所取代。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種能夠有效解決基于酶切位點(diǎn)基因融合問(wèn)題的方法，該方法基于一種新型的載體PUC19-TVG。同時(shí)該載體還能夠解決長(zhǎng)片段基因克隆過(guò)程中極易出現(xiàn)的錯(cuò)配問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)的技術(shù)方案提供了一種新型的載體PUC19-TVG，所述載體能夠便于實(shí)現(xiàn)多基因片段依賴酶切位點(diǎn)的融合及單一基因的分段和拼接，其特征在于，所述載體是基于限制性內(nèi)切酶酶切及連接原理由載體PUC19改造而來(lái)，載體中不含Xho1、Mlu1、Sac1、Kpn1、Cla I, EcoRV, Nco1、Pst1、Bglll、Sail、Pst1、BamH1、Sca1、XbaI 酶切位點(diǎn)，所述PUC19-TVG多克隆位點(diǎn)處序列為(SEQ ID NO :1)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。本專利技術(shù)公開(kāi)了 pUC19-TVG的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟I)引物設(shè)計(jì)及基因擴(kuò)增a.根據(jù)pUC19中多克隆位點(diǎn)區(qū)域序列設(shè)計(jì)反向引物TvectorG,TvectorG 5 ' ~AAGCTTGCGGCCGCACGCGTTATTCGCAGCATCCTCCG~3 ' (SEQ ID NO 2)；其中TvectorG的Y端包含酶切位點(diǎn)Hind II1、Not1、Mlu 1(下劃線所示)，為構(gòu)建質(zhì)粒及基因拼接提供連接端。b.在 TvectorG 和 pPICZ α 通用引物 5' AOX(5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3')的作用下，以pPICZ α質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出TVG片段并連至PUCm-T載體上，新載體命名為 pUCm-T-TVG。2)pUC19_TVG 質(zhì)粒的構(gòu)建a.對(duì)pUC19及pUCm-T-TVG載體使用Hind III和EcoR I進(jìn)行雙酶切，并回收pUC19 大片段及基因TVG。b.使用T4DNA連接酶對(duì)以上兩步獲得的片段進(jìn)行連接，得到新載體pUC19-TVG。本專利技術(shù)還公開(kāi)了基于PUC19-TVG質(zhì)粒的基因融合方法。具體包括以下步驟I)目的基因含酶切位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)為實(shí)現(xiàn)目的基因A和B的融合，首先根據(jù)兩基因的末端序列設(shè)計(jì)含有包括酶切位點(diǎn)EcoR1、Mlu I,Not I,Xho I,Hind III在內(nèi)的兩對(duì)引物，限制性酶切位點(diǎn)可根據(jù)后續(xù)步驟所連載體進(jìn)行選擇其中每個(gè)基因所使用的酶切位點(diǎn)前后不同、兩基因所使用的酶切位點(diǎn)前后對(duì)應(yīng)。使用該引物分別以目的基因A和B為模板進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物回收后連接至pUCm-T 載體上并獲得質(zhì)粒pUCm-T-Α和pUCm-T-B。2)目的基因A與pUC19-TVG載體的連接使用所選擇的兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pUC19-TVG和pUCm-T-Α進(jìn)行雙酶切，酶切回收PUC19-TVG大片段及A基因并使用DNA連接酶進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pUC19_TVG_A。3)目的基因A與B的融合使用所選擇的兩種限制性內(nèi)切酶中的任意一種和兩目的基因中均含有的單酶切位點(diǎn)對(duì)質(zhì)粒PUC19-TVG-A和pUCm-T-B進(jìn)行雙酶切，回收pUC19_TVG_A質(zhì)粒大片段和B基因片段并使用DNA連接酶進(jìn)行連接，獲得包含融合基因的質(zhì)粒pUC19-TVG-AB。本專利技術(shù)的有益成果本專利技術(shù)的目的是提供了一種新型的載體PUC19-TVG。該載體是基于限制性內(nèi)切酶酶切及連接原理由載體PUC19改造而來(lái)，載體中含有包括EcoR1、 Mlul、Notl、Xhol、HindIII 在內(nèi)的多克隆位點(diǎn)，不含 Xho1、Mlu1、Sac1、Kpn1、Cla1、 EcoRV、Nco1、Pst I,Bglll,Sal I,Pst I,BamH I,Sca I,Xba I 酶切位點(diǎn)，因此該載體能夠?qū)崿F(xiàn)多基因片段依賴酶切位點(diǎn)的融合及單一基因的分段和拼接，同時(shí)該載體還可以用于解決長(zhǎng)片段基因克隆過(guò)程中極易出現(xiàn)的錯(cuò)配問(wèn)題，具有一定的應(yīng)用潛力以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1 :質(zhì)粒pUC19-TVG的多克隆位點(diǎn)結(jié)構(gòu)示意圖具體實(shí)施方式本專利技術(shù)中所涉及的生物材料均為已公開(kāi)或商品化的材料，具體可通過(guò)以下方式獲得載體pUC19 :購(gòu)于 Novagen 公司；以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本專利技術(shù)的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本專利技術(shù)，而不用于限制本專利技術(shù)的范圍。實(shí)施例1質(zhì)粒pUC19-TVG的構(gòu)建質(zhì)粒pUC19-TVG的構(gòu)建流程具體步驟如下I)根據(jù)pUC19中多克隆位點(diǎn) 區(qū)域序列設(shè)計(jì)反向引物TvectorG,Tve本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種能夠有效解決基于酶切位點(diǎn)基因融合問(wèn)題的新載體pUC19?TVG，其特征在于多克隆位點(diǎn)處序列為(SEQ?ID?NO：1)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄔敏辰，朱天地，汪俊卿，李劍芳，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：