腦炎病毒蛋白及其編碼基因和應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種腦炎病毒蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)提供的蛋白是如下1）或2）的蛋白：1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2）將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白。本發(fā)明專利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明專利技術(shù)獲得的重組腺病毒vAd-E2E3有希望成為腦炎基因工程疫苗的候選疫苗。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種腦炎病毒蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
腦炎是由病毒直接侵犯或由病毒或其他異種蛋白引發(fā)的超敏反應(yīng)所致的大腦急性炎癥性疾病。腦炎可以是病毒性感染原發(fā)的臨床表現(xiàn)，或者是繼發(fā)的臨床表現(xiàn)，引起原發(fā)的腦炎的病毒有脊髄灰質(zhì)炎病毒，埃可病毒、柯薩奇病毒等流行性病毒，或散發(fā)性的通過蚊子、蝶等節(jié)肢動(dòng)物傳播的黃病毒屬的森林腦炎和批膜病毒科甲病毒屬的東方馬腦炎病毒坐寸o甲病毒為披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)成員，以蚊蝶等吸血昆蟲為傳播媒介，可引起多種人畜共患傳染病。近年來(lái)，國(guó)外已對(duì)多株甲病毒部分或全部序列測(cè)序。國(guó)內(nèi)對(duì)這類病毒的分子生物學(xué)研究亦取得一定的結(jié)果。已有的研究結(jié)果表明該病毒屬中和抗體決定簇主要集中在結(jié)構(gòu)蛋白El和E2等糖蛋白上，其中E2蛋白上所占比例更高。加之近年來(lái)腺病毒載體因具有安全性好、宿主范圍廣、感染效率高等多種優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于基因治療和基因工程疫苗研究，為此我們分析比較了多株甲病毒核苷酸序列，人工合成了同源性較高 的3kb的核苷酸，利用腺病毒載體構(gòu)建重組基因工程疫苗，為預(yù)防和治療疾病奠定了基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的ー個(gè)目的是提供一種與腦炎病毒疫苗相關(guān)蛋白及其編碼基因。本專利技術(shù)提供的蛋白E2E3，人工合成，是如下I)或2)的蛋白I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列2由529個(gè)氨基酸殘基組成，所述ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白質(zhì)E2E3的編碼基因也是本專利技術(shù)保護(hù)的范圍，所述編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所示的基因I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列I自5’末端第1-1589位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。含有上述編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌、表達(dá)盒或重組病毒也是本專利技術(shù)保護(hù)的范圍。所述重組載體為pAdeasy-1和重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)過同源重組得到的；所述重組穿梭質(zhì)粒是在載體PShuttle-CMV的KpNI和HindIII酶切位點(diǎn)間插入所述編碼基因得到的。所述重組病毒為重組腺病毒；所述重組腺病毒為將上述蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲得的重組腺病毒。所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞，優(yōu)選為離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其優(yōu)選為HEK-293細(xì)胞。本專利技術(shù)的另ー個(gè)目的是提供ー種疫苗。本專利技術(shù)提供的疫苗，其活性成分為如下任意ー種1)所述的蛋白；2)所述編碼基因；3)所述重組腺病毒。上述重組腺病毒在制備疫苗中的應(yīng)用也是本專利技術(shù)保護(hù)的范圍。所述疫苗為腦炎病毒疫苗。上述重組腺病毒在制備提高IFN- Y活性的增強(qiáng)劑中的應(yīng)用也是本專利技術(shù)保護(hù)的范圍。本專利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)證明，人工合成E2E3通過轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞而組裝成攜帯有目標(biāo)抗原基因的重組腺病毒vAd-E2E3。重組腺病毒vAd-E2E3感染293細(xì)胞能有效表達(dá)目的蛋白；通過滴鼻途徑接種BalB/C小鼠，利用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)特異性抗體水平，結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組腺病毒雖然產(chǎn)生特異性抗體的時(shí)間和維持的水平有所不同，但均產(chǎn)生了較好體液免疫反應(yīng)，為進(jìn)ー步開展免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)提供了重要的數(shù)據(jù)支持。由于病毒在機(jī)體內(nèi)極微量的蛋白表達(dá)即可激起免疫反應(yīng)，因此構(gòu)建的攜帯有腦炎病毒結(jié)構(gòu)基因的重組腺病毒vAd-E2E3，有希望成為腦炎基因工程疫苗的候選疫苗株。附圖說明圖1為pAd_E2E3酶切鑒定2為重組質(zhì)粒Pac I酶切和PCR鑒定具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。東部馬腦炎病毒(EasternEquine Encephalomyelitis virus) (HE Jing;CHANGGuoHui;WU Jin Song;LI ZhongDuo;ZHU QingYu Cloning and expression of E2geneof easternequine encephalomyelitis virus. Bulletin of The Academy of MilitaryMedicalSciences. 2002. 02.公眾可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。) HEK-293細(xì)胞(Invitrogen公司產(chǎn)品，Cat. No. R750-07);實(shí)驗(yàn)所需限制性內(nèi)切酶分別購(gòu)自TaKaRa和Biolabs公司;脂質(zhì)體Lipofectamin 2000購(gòu)自Invitrogen公司；Platinum pfx Taqase 購(gòu)自 Invitrogen 公 ロJ。實(shí)施例1、重組腺病毒(vAd-E2E3 )的獲得1、含有目的基因pAdtrack_E2E3的構(gòu)建及鑒定根據(jù)東部馬腦炎病毒(EasternEquine Encephalomyelitis virus) (NC-001547)的基因組序列，突變序列中的多個(gè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出序列表中的序列I，人工合成出序列I。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增編碼E2E3蛋白的基因，引物序列(引物分別含有KpNI和HindIII酶切位點(diǎn))見下E2E3-F: 5，-ACGGggtaccATGTCACTAGTGACCACCATGTGTCT-3，E2E3-R: 5，-ACCCaagcttACTAAAAAAGGCACGACACAG-3，以人工合成出序列I的DNA為模板，利用E2E3-F和E2E3-R引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到了預(yù)期大小一致的片段，約為1. 5Kb。經(jīng)測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中的序列I自5’末端第1-1589位核苷酸，將該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名E2E3，其OFR為序列I的自5’末端第1-1589位核苷酸，該基因編碼的蛋白命名為E2E3，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2，序列2由529個(gè)氨基酸殘基組成。 回收PCR產(chǎn)物，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行加“A”處理，處理后的PCR樣品與pMD_18T載體(TaKaRa公司產(chǎn)品，Code:D101A. Lot CK3201A)相連，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒后測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列I的自5’末端第1-1589位核苷酸插入pMD-18T得到的，命名為pTE2E3。用KpNI 和 HindIII 雙酶切重組質(zhì)粒 pTE2E3 和質(zhì)粒 pShuttle-CMV (Invitrogen公司產(chǎn)品，Catalog#240007),酶切產(chǎn)物分別用凝膠回收試劑盒切膠回收，并在T4DNA連接酶作用下于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB (Invitrogen公司產(chǎn)品，Cat.No. 18290-015)后挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列I的自5’末端第1-1589位核苷酸插入pShuttle-CMV的KpnI和HindIII酶切位點(diǎn)間得到的載體，命名為 pAdtrack_E2E3。2、重組腺病毒載體的構(gòu)建菌B本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
含有蛋白的編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒；所述蛋白，是如下1）或2）的蛋白：1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2）將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白。

【技術(shù)特征摘要】
1.含有蛋白的編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒； 所述蛋白，是如下I)或2)的蛋白 O由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白； 2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦耡l)、a2)或a3)或a4)所示的基因 al)序列表中序列I所不的DNA分子； a2)序列表中序列I自5’末端第1-1589位核苷酸所不的DNA分子； a3)在嚴(yán)格條件下與al)或a2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子； a4)與al)或a2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pAdeasy-Ι和重組...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：常國(guó)輝，林磊，吳曉燕，戶義，張雨，柳洪濤，李靖，羅彥軍，孫偉，康曉平，楊銀輝，祝慶余，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：