口服降血糖重組人胰島素原的制備方法技術

本發明專利技術涉及口服降血糖重組人胰島素原的產品及制備方法和應用，是利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與人胰島素原基因重組，帶有腸激酶標簽，構建融合表達的整合型重組質粒，并轉化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導重組菌株產生的芽孢表面展示人胰島素原的重組芽孢。本發明專利技術成功的篩選出重組枯草芽孢桿菌菌株，誘導重組菌株產生的芽孢表面展示有人胰島素原。本發明專利技術的重組芽孢可直接用于動物口服進行腸道消化吸收，在保持了芽孢生理特性的基礎上同時具有人胰島素原的部分藥效性和營養功能。同時，適合工業化生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及表面展示外源蛋白的重組芽孢的制備方法及產品，具體指的是在枯草芽孢桿菌芽孢表面展示帶有腸激酶標簽的人胰島素原HPI重組芽孢，屬于重組融合蛋白藥物

技術介紹
人胰島素原(human proinsulin, HPI)是由109個氨基酸組成的單鏈無糖基化的蛋白質，分子量約為 12kD (Bell GI, et al. 1979. Kyriazis GA, et al. 2012)，等電點在5.2左右。HPI是人體唯一降血糖激素胰島素的前體蛋白，體內和體外的研究均發現其能夠有效降低胰高血糖素 刺激的糖原分解，并結合胰島素受體發揮生物效應。人體內胰島素水平的長期失衡容易引起糖尿病，隨著人類社會的不斷發展和人民生活水平的不斷提高，糖尿病的患者人數也在不斷上升，其中中國已經成為世界上糖尿病患者最多的國家，2008年的流行病學分析顯示全國的總患病人數約為9200萬人，它被認為是二十一世紀威脅人類健康的沉默殺手。治療糖尿病患者的方法主要是胰島素的靜脈注射(胰島素注射液，商品名為諾和靈，諾和諾德生物制藥公司生產http://www. novonordisk. com ;胰島素的注射藥來得時，賽諾菲集團生產http://www. sanof1. cn/l/cn/zh/index, jsp),其給患者帶來了極大的精神痛苦，也容易引起高胰島素血癥、體重增加和低血糖等并發癥，并且糖尿病患者的治療費用昂貴(美國每名糖尿病患者的年治療費用達11744美元)，因此越來越多的研究開始專注于口服降血糖藥物的開發，目前中國的上市公司通化東寶正在進行口服胰島素膠囊的二期臨床開發(通化金馬 http://125. 35. 24. 210/cpi/jsp/preview_l. jsp TID=20080505093125243274372)，其胰島素的成分主要是發酵重組胰島素獲得。胰島素的生產早期主要是從動物的胰腺中純化結晶獲得的，到了二十世紀九十年代才開始了世界范圍內的重組胰島素制劑的研制，但是其生產工藝復雜且產量較低，很難滿足目前市場上對胰島素制劑的需求(每年大約有幾百億美元的市場價值)，其中胰島素原的生產就是嚴重制約胰島素制劑規模化的瓶頸。胰島素原對肝代謝有較強的選擇性作用，能夠有效抑制肝葡萄糖的輸出作用。利用胰島素原的灌注實驗發現其滅活時間遠長于胰島素，許多研究者認為可將其作為活性胰島素來治療糖尿病，臨床實驗也發現給2型糖尿病人注射胰島素原，可控制空腹血糖含量，且很少發生低血糖。目前已有通過基因工程的方法用酵母發酵生產重組人胰島素原，2010年德國亥姆霍茲中心感染研究所公布其畢赤酵母分泌發酵方法http://www.helmholtz-hz1.de/en/news_events/news/view/article/complete/new_pathway_to_cheapjnsulin/，但要實現藥物級重組人胰島素原的大規模生產，發酵法仍然有許多的缺點和不足，因為重組人胰島素原產品對純度要求極高，純度要求達到99. 999999%以上，任何微量的雜蛋白都可能造成嚴重的免疫反應。這使得發酵法生產重組人胰島素原的分離純化方法和步驟復雜,生產成本較高。枯草芽孢桿菌為環境友好型細菌，對弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害細菌有很強的抑制作用，營養缺乏時能形成處于代謝休眠狀態的芽孢，在適宜條件下芽孢又能萌發成具有繁殖能力的營養細胞，產生大量多種維生素、有機酸、氨基酸、蛋白酶、糖化酶等促進消化吸收的物質。芽孢容易培養，比重大易分離、不需要復雜的分離純化操作。芽孢是生物界中抗逆性最強的生命體，其穩定性好，能耐氧化，耐高溫，能長期耐60°C高溫，在120°C 140°C還能生存幾小時，并且在抗化學藥物和抗輻射等方面也十分突出，可在惡劣環境中存活幾年至幾十年。芽孢在酸性胃環境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的攻擊，順利通過動物消化道直達大小腸，可作為極端環境(如胃腸道)下異源蛋白或生物活性分子的載體(Oggioni MR, et al. 2003. Vaccine. 21:96-101)。枯草芽孢桿菌以孢子狀態進入消化道后，迅速由休眠狀態復活，在短期內繁殖成高含菌量的優勢種群，消耗掉腸道內大量氧氣，并能產生過氧化氫、細菌素，建立微生態平衡，促進有益厭氧微生物的繁殖，抑制有害細菌(大腸桿菌、沙門氏桿菌)的生長，因而能預防腹瀉、下痢等腸胃道疾病，增強機體的免疫力和體質水平。目前市場上已經有口服枯草芽孢桿菌活菌膠囊產品，北京紫竹藥業有限公司，國藥準字 S20030018(http://www. 777aaa. com/html/yao/200791823402711963569029. htm)，表明枯草芽孢桿菌芽孢可以通過人口服使用而產生藥效性。家蠶具有類似哺乳動物和人的腦、心臟、肝臟、腎臟、胃腸、神經、肌肉等類似器官和組織，對藥劑的反應和對病原物的感受性與人相當一致。實踐也證明用蠶作人類疾病研究和開發新醫藥的新的模式動物在第一階段使用很好，試驗快速、簡便、成本低。同時家蠶作為藥物初篩的模式動物還具有不逃逸，體外可以進行藥物吸收性試驗等優點，因此越來越多的研究開始用家蠶作為藥物篩選的初級動物模型。家蠶和人同樣具備調節血液中糖濃度即血糖值的功能，先前的實驗顯示過高的血糖濃度會使家蠶的生長發育受到抑制并且胰島素可以降低家蠶血糖的含量，也就是說家蠶存在著與人體類似的血糖調節機制，本研究首次希望通過創建家蠶的糖尿病模型來篩選一些胰島素類似物，同時為下面開發臨床應用的膜島素口服制劑提供實驗基礎。 本專利技術的目的在于根據人體胃腸道的消化特征，以益生菌枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白為載體，通過芽孢展示技術將帶有腸激酶標簽Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的人胰島素原展示在芽孢表面，使人胰島素原獲得快速大量表達具有良好抗逆性的同時能夠在人體腸道進行增殖和自由消化吸收，適用于快速大量制備具有降血糖功效的重組人胰島素原的口服藥物。該產品結合了枯草芽孢桿菌的抗逆性特征和人體胃腸道的消化特點，增加了腸激酶位點，開發出能夠在人體口服進行自由消化吸收的降血糖多肽藥物，同時，能進行大規模的工業生產，迄今尚未見類似的報道和專利技術專利。本專利技術通過家蠶糖尿病模型進行降血糖藥物的初級篩選。首次成功構建家蠶糖尿病模型的各項生理生化指標符合糖尿病模型的標準，通過人胰島素原重組芽孢的糖尿病模型家蠶口添實驗，證明了本產品的降血糖功效，這也是首例應用家蠶糖尿病模型成功進行降血糖藥物篩選的產品。
技術實現思路
為了解決口服降血糖藥物開發存在的問題，本專利技術提供了一種表面展示人胰島素原HPI的重組芽孢的制備方法和產品。本專利技術以枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC為載體，通過芽孢表面展示技術將帶有腸激酶標簽Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的人胰島素原展示在枯草芽孢桿菌的芽孢表面，可用于動物直接口服，成為一種新型的人胰島素原降血糖藥物，其在安全性、耐受性、藥效學以及藥代動力學等方面與胰島素具有類似的功效。相對于其它注射型胰島素產品，本專利技術表面展示人胰島素原的制備方法主要用于口服易于吸收，同時具有工業化生產特點，具有更廣泛的應用價值。這種產品的專利技術克服了當前人胰島素來源于胰腺組織提取的限制，同時也克服本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種口服降血糖重組人胰島素原的制備方法，其特征在于：利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與人胰島素原基因重組，帶有腸激酶標簽，構建融合表達的整合型重組質粒，并轉化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導重組菌株產生的芽孢表面展示人胰島素原的重組芽孢。

【技術特征摘要】
1.一種口服降血糖重組人胰島素原的制備方法，其特征在于利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為分子載體，與人胰島素原基因重組，帶有腸激酶標簽，構建融合表達的整合型重組質粒，并轉化枯草芽孢桿菌得到枯草芽孢桿菌重組菌株，誘導重組菌株產生的芽孢表面展示人胰島素原的重組芽孢。2.按照權利要求1所述的口服降血糖重組人胰島素原的制備方法，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因是CotC。3.按照權利要求2所述的口服降血糖重組人胰島素原的制備方法，其特征在于所述的融合表達的整合型重組質粒是將枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因與人胰島素原基...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳克平，馮凡，胡平，連超群，呂鵬，唐琪，姚勤，袁弋，張春霞，陳亮，
申請(專利權)人：江蘇大學，
類型：發明
國別省市：