本發明專利技術涉及基因工程技術領域，具體涉及到一種蛋白質表達質粒，該質粒能夠將表達的外源蛋白展示在細胞表面，并且能夠將表達的外源蛋白從細胞表面自動釋放出來。該質粒在商品質粒pET20b的多克隆位點插入INP基因和Intein基因，并在Intein基因3’端構建了多克隆位點（MCS，包括Nco?I，Xba?I，EcoR?I和Xho?I）。將外源蛋白基因插入到質粒pINP-Intein多克隆位點后，獲得重組表達載體；再轉入大腸桿菌表達宿主，經誘導表達后，插入到質粒多克隆位點的外源蛋白基因不但能夠展示在細胞表面，而且能夠在Intein的剪切作用下從細胞表面釋放出來。該表達質粒在蛋白質及多肽文庫的篩選、酶和抗體的制備以及全細胞生物催化等方面具有潛在的應用價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程
，具體涉及到一種蛋白質表達質粒，該質粒能夠將表達的外源蛋白展示在細胞表面，并且能夠將表達的外源蛋白從細胞表面自動釋放出來。
技術介紹
細胞表面展示技術是以細胞表面蛋白為運載蛋白，通過基因工程手段將外源蛋白與細胞表面蛋白進行融合表達，通過細胞表面蛋白的攜帶將外源蛋白展示在細菌或者酵母菌的細胞表面，從而使完整細胞具有了新的功能。自上個世紀八十年代中期第一個細菌細胞表面展示體系建立以來，細胞表面展示技術在活體疫苗、肽庫篩選、抗體生產、生物吸附、 全細胞催化、生物傳感器和酶定向進化等生物領域得到了廣泛應用。在各種運載蛋白中， 冰核蛋白(Ice Nucleation Protein, INP)是載運能力最大的運載蛋白，運載蛋白的分子量最高可達到100kD。假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Xanthomonas)和歐文氏菌屬 (Erwinia)中的某些細菌，其細胞表面包含INP，在過冷條件下INP能催化水生成冰晶。研究表明，天然INP具有三個結構域，N端結構域與磷脂層的外層相互作用，C端結構域高度親水并暴露于外膜，中間是重復序列，作為冰晶核模板起到催化作用。根據INP的結構特點， 已經構建了 INP全長展示系統、無中間重復序列展示系統以及含部分中間重復序列的展示系統。目前以INP為運載蛋白，已經成功地將金屬調整蛋白(metal Ioregulatory protein, MerR)> 有機憐水解酶(organophosphate hydrolase)、羧酸酯酶 (carboxy I esterase )> 甲基對硫憐水解酶(Methyl parathion dydrolase)、纖維素酶 (cellulase)展示在大腸桿菌、根瘤菌(Rhizobium)、摩拉克氏菌(Moraxella)、假單胞菌細胞的表面。雖然這些蛋白被成功的展示在了細胞表面，發揮了它們的作用，但這些蛋白也被固定在了細胞表面，對進一步研究(如純化、性質表征和定向進化等)和應用帶來了很多限制。為了克服上述問題，我們期望能夠構建一種新的細胞表面展示質粒，使展示在細胞表面的外源蛋白能夠從細胞表面解離下來，從而拓展細胞表面展示技術的應用范圍。蛋白內含子(Intein)又稱內蛋白子，是前體蛋白質中的一段插入序列。其功能是在蛋白翻譯后成熟過程中，能自動準確切除蛋白內含子及兩側蛋白外顯子序列，并以正常的肽鍵連接形成成熟蛋白，這個過程稱為蛋白剪接(protein splicing)。Intein對應的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白對應的核酸序列之中，與宿主蛋白質基因存在于同一開放閱讀框 (openreadingframe, 0RF)內，并與宿主蛋白質基因進行同步轉錄和翻譯，當形成蛋白質前體之后， Intein從宿主蛋白質中被切除，從而形成成熟的具有活性的蛋白。蛋白內含子目前主要用于蛋白的純化、毒性蛋白的表達、蛋白環化等方面。基于目前細胞表面展示技術存在的不足以及Intein所具有的生物學功能，本專利技術擬將這兩項技術相結合，構建具有細胞表面展示并自動釋放功能的蛋白質表達載體，以拓展細胞表面展示技術的應用范圍。
技術實現思路
本專利技術的目的是為生物
提供一個新的細胞表面展示質粒，是在質粒 pET20b的多克隆位點插入序列如SEQ ID NO. 9所示的基因片段。該質粒既可以使插入到多克隆位點的外源蛋白展示在細胞表面，又可以在一定條件下使外源蛋白從細胞表面自動釋放出來，可用于外源蛋白在大腸桿菌的分泌表達、蛋白質和酶的定向進化、全細胞的生物催化。本專利技術首先提供了一種新的細胞表面展示質粒,其特點是在商品質粒pET20b的多克隆位點插入INP基因和Intein基因，并在Intein基因3’端構建了多克隆位點(MCS， 包括Nco I，Xba IjEcoR I和Xho I)。通過分子生物學技術將外源蛋白基因插入到質粒多克隆位點后，獲得重組表達載體；再將重組表達載體轉入大腸桿菌表達宿主，如BL21，經誘導表達后，插入到質粒多克隆位點的外源蛋白基因不但能夠展示在細胞表面，而且能夠在 Intein的剪切作用下自動從細胞表面釋放出來。所述的INP基因，其編碼的氨基酸序列與來源于細菌Pseudomonas syringae的冰核蛋白(在GenBank中的登錄號為CBI99147.1)的N端部分片段以及C端部分片段相一致， 刪除了原始蛋白中的中間片段。所述的Intein基因，其編碼的氨基酸序列與來源于古菌Synechocystis Sp. Pcc6803的Intein氨基酸序列(在GenBank中的登錄號為ABD24064.1)的部分片段相一致，但是根據大腸桿菌密碼子的偏嗜性，對Intein氨基酸所對應的密碼子進行了重新編碼和人工設計合成。其次，本專利技術提供了一種利用上述載體將外源蛋白展示在細胞表面并能夠使目標蛋白自動從細胞表面解離下來的方法，其特點是包括以下步驟a.使用常規分子生物學技術，如酶切連接、基因重組等方法，將外源蛋白基因插入到質粒ρΙΝΡ-1ntein的多克隆位點，獲得重組表達載體；b.可以使用常規的轉化方法，如化學轉化、電轉化等，將所構建的重組表達載體轉入表達宿主，如大腸桿菌B121，通過添加IPTG進行誘導表達，獲得融合蛋白并被展示在細胞表面，所述融合蛋白包括所述冰核蛋白片段(INP)，所述蛋白內含子(Intein)，所述外源蛋白和所述寡聚組氨酸親和純化標簽。c.融合蛋白中的蛋白內含子(Intein)可以自動將位于其C端的外源蛋白和寡聚組氨酸親和純化標簽從細胞表面剪切下來，剪切下來的外源蛋白的C末端融合寡聚組氨酸親和純化標簽，因而外源蛋白容易被濃縮純化。所述的蛋白內含子自動剪切作用，其效率可以通過外界條件的變化而發生變化。所述的外界條件包括溫度，pH值，時間以及β_巰基乙醇，所述的溫度，其范圍為 (20至40)°C，所述的pH范圍為4. O至7. 9，所述的時間范 圍為2_60小時，所述β -巰基乙醇，其濃度范圍為0%至O. 1%。本專利技術的優勢本專利技術提出了一種新的細胞表面展示并能使被展示的蛋白從細胞表面自動解離下來的方法，本專利技術所設計構建的表達質粒擁有如下優勢I)插入到多克隆位點的外源蛋白基因經誘導后，以融合蛋白的形式展示在細胞表面；2)展示在細胞表面的外源蛋白可以自動從細胞表面解離下來，通過改變外界因素可以對外源蛋白的解離速度和效率加以控制；3)在未額外加入終止子的條件下，外源蛋白的C末端會融合表達組氨酸標簽，可以方便的使用親和層析的方法把外源蛋白純化出來。本專利技術所提出的方法以及所設計構建的表達質粒在蛋白質及多肽文庫的篩選、酶和抗體的制備以及全細胞生物催化等方面具有潛在的應用價值。附圖說明圖1 :本專利技術的重組質粒pET20b_INP的載體圖譜；其中INP是指冰核蛋白基因， MCS是指多克隆位點，包括Nco1、Xba1、Eco I和Xho I限制性酶切位點。圖2 :本專利技術圖1所示重組質粒pET20b_INP的構建流程圖3 :本專利技術構建的重組質粒pET20b_INP序列測定圖，其中黑框標出的是目的片段部分。圖4 :本專利技術的重組質粒pINP-1ntein的載體圖譜，其中INP是指冰核蛋白基因， Intein是指蛋白本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種蛋白質表達質粒pINP?Intein，其特征在于：是在質粒pET20b的多克隆位點插入序列如SEQ?ID?NO.9所示的基因片段，其結構如下所示，FDA00002695254100011.jpg
【技術特征摘要】
1.一種蛋白質表達質粒pINP-1ntein,其特征在于是在質粒pET20b的多克隆位點插入序列如SEQ ID NO. 9所示的基因片段，其結構如下所示，2.權利要求1所述的一種蛋白質表達質粒pINP-1ntein在將蛋白展示在細胞表面并自動釋放出來方面的應用。3.如權利要求2所述的一種蛋白質表達質粒pINP-...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張作明，高文英，張紅，周余來，陳彥彥，
申請(專利權)人：吉林大學，
類型：發明
國別省市：
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