檢測活運動神經(jīng)元蛋白質的表達的方法技術

本發(fā)明專利技術涉及一種檢測SMN蛋白質的表達的方法，其包含：對含有源自血液的有核細胞的樣品中的SMN蛋白質進行標識的工序；對所述樣品中的所述有核細胞的核進行標識的工序；對所述有核細胞中的核及SMN蛋白質被標識了的細胞群進行分選的工序；以及對所述分選出的細胞群，基于對SMN蛋白質的標識對SMN蛋白質的表達進行檢測的工序。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種檢測活運動神經(jīng)元(SMN)蛋白質的表達的方法。
技術介紹
脊髓性肌肉萎縮癥(SMA)為由于脊髓前角細胞的病變而引起的肌肉萎縮癥，顯示以軀干或四肢的肌肉力量降低及肌肉萎縮為特征的下運動神經(jīng)元癥狀。SMA根據(jù)發(fā)病年齡和重癥程度分為I型～IV型，至出生后6個月發(fā)病的I型：重癥型(也稱為韋霍麻痹)、至1歲6個月發(fā)病的II型：中間型(也稱為Dubowitz病)、及在1歲6個月以后發(fā)病的III型：輕癥型(也稱為Kugelberg-Welander病)為幼兒期發(fā)病SMA。另一方面，在20歲以后發(fā)病的IV型為成人發(fā)病SMA。I型SMA占SMA的約30％，在6個月以下發(fā)病。其癥狀極其深刻，不能保持生活坐姿，極少不用人工呼吸而可以生存2歲以上的情況。II型SMA不能進行生活起立及行走，III型SMA雖然獲得自行直立行走，但是，容易轉移至下一階段，出現(xiàn)不能行走或不能站立的癥狀。但是，SMA的根本治療法依然未能確立，SMA為國家指定的難治之癥中的一個。許多幼兒期發(fā)病SMA的原因基因為存在于第5號染色體長臂5q13的SMN1基因。在許多幼兒期發(fā)病SMA中，可確認到SMN1基因的缺失或變異，幼兒期發(fā)病SMA作為常染色體隱形遺傳性疾病被識別。由SMN1基因表達SMN蛋白質，認為SMN蛋白質參與運動神經(jīng)元的形成等。另外，在SMN1基因存在的第5號染色體的相同區(qū)域中，存在有SMN2基因，其編碼區(qū)域的堿基僅1個與SMN1基因不同。在幼兒期發(fā)病SMA患者中，SMN1基因缺失或變異，源自SMN1基因的SMN蛋白質降低，另一方面，SMN2基因正常地起作用。因此，在幼兒期發(fā)病SMA患者中，源自SMN2基因的SMN蛋白質也進行表達，根據(jù)源自該SMN2基因的SMN蛋白質的表達量，認為癥狀的重癥度不同。但是，SMN1基因的轉錄產(chǎn)物為全長SMNmRNA，與此相對，將由SMN1基因所轉錄的全長SMNmRNA的量設為100％時，SMN2基因的轉錄產(chǎn)物大約為全長SMNmRNA的10％，確認了外顯子7缺失的短縮型SMNmRNA為大約90％。短縮型SMNmRNA翻譯成非功能性的蛋白質，僅全長SMNmRNA正常地翻譯成SMN蛋白質，因此，在SMN1基因缺失或變異的幼兒期發(fā)病SMA患者中，SMN蛋白質的表達量與正常人相比低，僅正常人的10％～20％左右。因此，由于SMN1基因缺失或變異，產(chǎn)生肌肉力量降低及肌肉萎縮。在SMN1基因缺失的幼兒期發(fā)病SMA患者中，SMN2基因有時替換SMN1基因而存在。該情況下，SMN2基因在1個染色體上存在2個拷貝，源自SMN2基因的SMN蛋白質的表達量也根據(jù)拷貝數(shù)而變多。得知：在幼兒期發(fā)病SMA患者中，源自SMN2基因的SMN蛋白質的表達量越增加，癥狀越變輕。如上所述，SMN蛋白質的表達量與幼兒期發(fā)病SMA密切地關聯(lián)，SMN蛋白質認為有可能成為用于幼兒期發(fā)病SMA的診斷、或用于可靠地判斷藥劑的效果的有用的生物標記。但是，在幼兒期發(fā)病SMA患者中，對SMN蛋白質的表達自身進行確認，為了將SMN蛋白質作為幼兒期發(fā)病SMA的有用的生物標記利用，需要在將正常人和患者進行比較時能夠檢測出SMN蛋白質表達水平的差異的程度的敏銳度。另外，幼兒期發(fā)病SMA為常染色體隱形遺傳性疾病，在1對常染色體中的一條染色體中僅SMN1基因缺失或變異的情況下，沒有出現(xiàn)任何肌肉力量降低及肌肉萎縮的癥狀，稱為攜帶者。在攜帶者中，雖然與患者相比SMN蛋白質的表達量高，但是，認為在攜帶者和患者之間，不存在如正常人和患者之間的SMN蛋白質的表達量之差那么大的差異。因此，為了將SMN蛋白質作為幼兒期發(fā)病SMA的有用的生物標記利用，需要在將攜帶者和患者進行比較時能夠檢測出SMN蛋白質表達水平的差異的程度的更進一步的敏銳度。實際上嘗試了使用有末梢血單核球細胞的、利用ELISA法的SMN蛋白質的定量分析(Dione T.Kobayashi et al.,Plos one,November 2012,Vol.7,Issue11,e50763,Evaluation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Processing and Analysis for Survival Motor Neuron Protein)。但是，Kobayashi等報道有如下結果：在幼兒期發(fā)病SMA患者和攜帶者之間，用ELISA法不能確認到SMN蛋白質表達水平上的顯著差異。并且，Kobayashi等甚至公開了SMN蛋白質表達水平在SMA的診斷中不能成為具有可靠性的指標。另外，在利用ELISA法的SMN蛋白質的定量分析中，必須使用末梢血單核球細胞(PBMC)，對從患者等得到的血液樣品進行離心分離等需要花費時間，并且細胞的收率也降低。因此，利用使用PBMC的ELISA法的SMN蛋白質的定量中，所需要的采血量也增大。如上所述，在現(xiàn)有技術中，為了將SMN蛋白質作為幼兒期發(fā)病SMA的有用的生物標記而利用，存在各種各樣的問題，對SMA的根本治療法的確立成為很大的障礙。另外，使用全血(末梢血)或使全血中的紅細胞溶血而得到的物質等血液樣品，至今沒有報道能夠檢測出對正常人和幼兒期發(fā)病SMA患者進行比較后的SMN蛋白質表達水平的差異的，且具有可靠性的SMN蛋白質的檢測方法。
技術實現(xiàn)思路
目前，在幼兒期發(fā)病SMA患者和正常人之間、和/或在幼兒期發(fā)病SMA患者和攜帶者之間，能檢測出SMN蛋白質表達水平的差異的，且使用了血液細胞樣品的具有可靠性的SMN蛋白質表達的檢測方法尚未被發(fā)現(xiàn)。本專利技術的目的在于，提供一種在幼兒期發(fā)病SMA患者和正常人之間、和/或在幼兒期發(fā)病SMA患者和攜帶者之間，能夠檢測出SMN蛋白質表達水平的差異的，且使用了血液細胞樣品的具有可靠性的檢測SMN蛋白質的表達的方法。本專利技術人等重復進行了深入研究的結果重新發(fā)現(xiàn)：關于檢測SMN蛋白質的表達的細胞，從血液細胞中分選特定的細胞群，對在該細胞群中SMN蛋白質的表達進行檢測，由此提高SMN蛋白質表達水平的檢測靈敏度。在本專利技術的一個實施方式中，是對SMN蛋白質的表達進行檢測的方法，所述方法包括：對含有源自血液的有核細胞的樣品中的SMN蛋白質進行標識的工序；對所述樣品中的所述有核細胞的核進行標識的工序；對所述有核細胞中的核及SMN蛋白質被標識了的細胞群進行分選的工序；以及對所述分選出的細胞群，基于對SMN蛋白質的標識檢測SMN蛋白質的表達的工序。本專利技術的一個實施方式中，在SMN蛋白質表達的檢測方法中，對含有源自血液的有核細胞的樣品中的SMN蛋白質進行標識的工序包含利用第1熒光色素標識SMN蛋白質，且對SMN蛋白質的表達進行檢測的工序包含對所述第1熒光色素發(fā)出的熒光強度進行測定。本專利技術的一個實施方式中，在SMN蛋白質表達的檢測方法中，對含有源自血液的有核細胞的樣品中的SMN蛋白質進行標識的工序包含利用第1熒光色素標識SMN蛋白質，且標識含有源自血液的有核細胞的樣品中的有核細胞的核的工序包含利用第2熒光色素標識核。本專利技術的一個實施方式中，在SMN蛋白質表達的檢測方法中，對有核細胞中的核及SMN蛋白質被標識了的細胞群進行分選的工序包含：在同一裝置內，對第1熒光色素發(fā)出的第1熒光強度和第2熒光色素發(fā)出的第2熒光強度進行測本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種檢測方法，其是對SMN蛋白質的表達進行檢測的方法，該方法包括：對含有源自血液的有核細胞的樣品中的SMN蛋白質進行標識的工序；對所述樣品中的所述有核細胞的核進行標識的工序；對所述有核細胞中的核及SMN蛋白質被標識了的細胞群進行分選的工序；以及對所述分選出的細胞群，基于對SMN蛋白質的標識檢測SMN蛋白質的表達的工序。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.04.03 JP 2014-0769851.一種檢測方法，其是對SMN蛋白質的表達進行檢測的方法，該方法包括：對含有源自血液的有核細胞的樣品中的SMN蛋白質進行標識的工序；對所述樣品中的所述有核細胞的核進行標識的工序；對所述有核細胞中的核及SMN蛋白質被標識了的細胞群進行分選的工序；以及對所述分選出的細胞群，基于對SMN蛋白質的標識檢測SMN蛋白質的表達的工序。2.如權利要求1所述的方法，其中，所述標識SMN蛋白質的工序包含利用第1熒光色素對SMN蛋白質進行標識，且所述檢測SMN蛋白質的表達的工序包含對所述第1熒光色素發(fā)出的熒光強度進行測定。3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述標識SMN蛋白質的工序包含利用第1熒光色素標識SMN蛋白質，且所述標識核的工序包含利用第2熒光色素標識核。4.如權利要求3所述的方法，其中，所述分選細胞群的工序包含：在同一裝置內對所述第1熒光色素發(fā)出的第1熒光強度和所述第2熒光色素發(fā)出的第2熒光強度進行測定，以及將測定得到的第1熒光強度及第2熒光強度表示于二維坐標上。5.如權利要求1～4中任一項所述的方法，其中，所述分選細胞群的工序及所述檢測SMN蛋白質的表達的工序利用成像流式細胞儀進行。6.如權利要求1～5中任一項所述的方法，其中，所述含有源自血液的有核細胞的樣品包含如下得到的有核細胞：使血液中的紅細胞溶血，接著通過離心分離而使有核細胞沉淀。7.一種檢測方法，其是對SMN蛋白質進行檢測的方法，所述...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：齋藤加代子，荒川玲子，荒川正行，野本明男，
申請(專利權)人：學校法人東京女子醫(yī)科大學，公益財團法人微生物化學研究會，
類型：發(fā)明
國別省市：日本;JP