本發(fā)明專利技術(shù)涉及在細(xì)菌宿主中生產(chǎn)重組毒素蛋白的領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)尤其涉及從細(xì)菌宿主中獲得高水平重組CRM?197、白喉毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)類毒素C片段、霍亂毒素B、霍亂全毒素和假單胞菌外毒素A的生產(chǎn)方法。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】重組毒素蛋白的高水平表達(dá)優(yōu)先權(quán)要求本申請(qǐng)根據(jù)35 U. S. C. $119(e)要求2010年4月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/325，235,2010年4月9日提交的PCT/US 10/30573和2010年3月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/319，152的優(yōu)先權(quán)。這些申請(qǐng)的內(nèi)容特此通過引用整體并入本文。序列表本申請(qǐng)包含通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，該序列表特此通過引用整體并入本文。創(chuàng)建于2011年3月16日的所述ASCII拷貝被命名為38194201. txt，其大小為156，975個(gè)字節(jié)。專利技術(shù)背景 微生物毒素蛋白在醫(yī)學(xué)中用作針對(duì)產(chǎn)生毒素的微生物的疫苗接種的免疫原以及用作其他疫苗的載體蛋白質(zhì)和佐劑，并且在科學(xué)研究中用作研究分子途徑的工具。白喉毒素(DT)是由白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium diphtheriae)的產(chǎn)毒菌株合成和分泌的蛋白質(zhì)性毒素。產(chǎn)毒菌株含有攜帯毒素基因的噬菌體溶素原。DT被合成為535個(gè)氨基酸的多肽，其經(jīng)歷蛋白水解以形成成熟的毒素。成熟的毒素包含由ニ硫鍵連接的兩個(gè)亞基A和B。由完整DT的C末端部分形成的B亞基使DT能夠結(jié)合細(xì)胞膜并通過細(xì)胞膜進(jìn)入到胞質(zhì)中。一旦進(jìn)入細(xì)胞，由完整DT的N末端部分形成的酶的A亞基催化延伸因子2 (EF-2)的ADP核糖基化。其結(jié)果是，EF-2被滅活、蛋白質(zhì)合成停止和細(xì)胞死亡。白喉毒素是高度細(xì)胞毒性的，單個(gè)分子可以致死細(xì)胞，且10ng/kg的劑量可以殺死動(dòng)物和人。CRM197蛋白是DT的無毒的、免疫學(xué)交叉反應(yīng)的形式。已研究了其作為DT增強(qiáng)劑或疫苗抗原的潛在用途。CRM197是通過由產(chǎn)毒的P棒狀桿菌噬菌體的亞硝基胍誘變構(gòu)建的非產(chǎn)毒噬菌體P 197tQX_感染的白喉?xiàng)U菌產(chǎn)生的。CRM197蛋白具有與DT相同的分子量，但在A亞基中有單堿基變化(鳥嘌呤變?yōu)橄汆堰?的差異。這ー單堿基變化導(dǎo)致氨基酸置換(谷氨酸置換為甘氨酸)，并消除了 DT的毒性性質(zhì)。使用CRM197作為載體蛋白的結(jié)合多糖疫苗已批準(zhǔn)人體使用。疫苗包括MenVe0 (Novartis Vaccines and Diagnostics)(標(biāo)明用于預(yù)防由腦膜炎球菌亞群A、C、Y和W-135引起的侵襲性腦膜炎球菌疾病的疫苗)、Menjugate (Novartis Vaccines)(腦膜炎雙球菌C群結(jié)合疫苗)、和Prevnar (Wyeth Pharmaceuticals, Inc.)(革巴向于肺炎鏈球菌的七種血清型的兒童肺炎疫苗)和HibTITER (Wyeth)(流感嗜血桿菌b型疫苗)。此外，CRM197具有用作白喉?xiàng)U菌疫苗接種的增強(qiáng)抗原的潛力并正在研究作為用于其它疫苗中的載體蛋白。用于批準(zhǔn)的治療和研究用途的CRM197高水平表達(dá)的方法尚未見報(bào)道。CRM197已在例如白喉?xiàng)U菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌中以數(shù)十mg/L的水平表達(dá)。單劑Prevnar結(jié)合疫苗含有大約20ii g CRM197。因此，用于經(jīng)濟(jì)地以約lg/L或以上的水平生產(chǎn)CRM197的方法將極大地促進(jìn)疫苗研究和生產(chǎn)。由霍亂弧菌(Vibrio cholera)產(chǎn)生的霍亂毒素(CTX)是ー種導(dǎo)致以腹瀉和嘔吐為特征的感染的細(xì)菌性病原體，也是ー種ADP-核糖基化毒素。CTX是由六個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成的低聚復(fù)合物單ー拷貝的霍亂毒素A亞基(CTA)和五個(gè)拷貝的霍亂毒素B亞基(CTB)。這五個(gè)各重12kDa的B亞基形成了ー個(gè)五元環(huán)。A亞基具有Al部分CTAl和A2鏈CTA2，CTAl是將G蛋白進(jìn)行ADP-核糖基化的球狀酶，而CTA2形成緊靠地位于B亞基環(huán)中心孔中的伸展的a螺旋。該環(huán)結(jié)合到宿主細(xì)胞表面上的GMl神經(jīng)節(jié)苷脂受體上，導(dǎo)致整個(gè)復(fù)合物的內(nèi)化。一旦內(nèi)化，CTAl鏈通過ニ硫鍵的還原釋放。然后CTAl被激活并且催化腺苷酸環(huán)化酶的ADP核糖基化。由此導(dǎo)致的腺苷酸環(huán)化酶活性的增強(qiáng)提高了環(huán)AMP的合成，這導(dǎo)致大量的流體和電解質(zhì)流出并且導(dǎo)致腹瀉。CTX的B亞基盡管是相對(duì)無害的，但仍保留了其結(jié)合到GMl神經(jīng)節(jié)苷脂受體上的能力。因此，CTB可用于促進(jìn)化學(xué)地或遺傳地偶聯(lián)的外來抗原的粘膜攝取。已證實(shí)其誘導(dǎo)粘膜免疫和系統(tǒng)免疫，并且是用于可食用疫苗的生產(chǎn)的候選物。由于其結(jié)合偏好，CTB也可用作神經(jīng)元示蹤物。百日咳毒素(PTX) 是由導(dǎo)致百日咳病的人呼吸道細(xì)菌性病原體百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)產(chǎn)生的外毒素和毒力因子。百日咳全毒素是具有AB 5結(jié)構(gòu)的多亞基復(fù)合物。酶活性的A亞基(SI)是修飾哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)幾種異三聚體G蛋白的a亞基的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，而B低聚物(S2、S3、兩個(gè)拷貝的S4和S5)結(jié)合細(xì)胞上的糖結(jié)合物受體。該毒素的五個(gè)亞基由百日咳類毒素操縱子表達(dá)。已研究了用于保護(hù)性疫苗和用作疫苗佐劑的百日咳毒素的無毒變異體。也需要百日咳毒素蛋白來用于研究，例如用于對(duì)G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究。由破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素是具有150kDa分子量的神經(jīng)毒素。它由以下兩部分組成100kDa重鏈或B-鏈和50kDa輕鏈或A-鏈。這些鏈通過ニ硫鍵連接。B鏈結(jié)合到位于神經(jīng)元膜上的ニ唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(⑶2和⑶Ib)上。A鏈(一種鋅內(nèi)肽酶)攻擊囊泡相關(guān)膜蛋白(VAMP)。A鏈的作用通過降解小突觸泡蛋白阻止了受影響的神經(jīng)元釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA( Y-氨基丁酸)和甘氨酸。其后果是最小刺激引起肌肉的危險(xiǎn)的過度活動(dòng)ー感官刺激對(duì)運(yùn)動(dòng)反射的抑制失敗。這導(dǎo)致主動(dòng)肌和拮抗肌肌肉組織的全身性收縮，被稱為強(qiáng)直性痙攣。破傷風(fēng)毒素C片段(Tet C或TTC)是通過破傷風(fēng)毒素的蛋白酶切割(例如用木瓜蛋白酶)或通過片段的重組表達(dá)而產(chǎn)生的50kD的多肽。它對(duì)應(yīng)于C-末端的451個(gè)氨基酸(氨基酸位置865-1315)。C片段已表明為無毒性的。因?yàn)樗愿咛禺愋院陀H和カ與神經(jīng)元結(jié)合，TTC可用作神經(jīng)元藥物遞送的靶向分子或用于研究目的。TTC蛋白也可潛在地用作疫苗載體蛋白并且在疫苗中用來避免破傷風(fēng)梭菌感染。艱難梭菌(Clostridium difficile)毒素B(TcdB)是由艱難梭菌產(chǎn)生的毒力因子，它導(dǎo)致醫(yī)院獲得性腹瀉和假膜性結(jié)腸炎。TcdB和第二大梭菌毒素TcdA參與了假膜性結(jié)腸炎的發(fā)生。TcdB是約270kD的葡糖基化毒素，且可分成酶、易位和受體結(jié)合域。TcdB的前546個(gè)氨基酸包含酶區(qū)域，接著是推定的易位和受體結(jié)合域。TcdB具有作為艱難梭菌感染的保護(hù)性疫苗以及用于診斷檢驗(yàn)及其開發(fā)的潛在用途。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A (ETA或PE)是一種II型ADPRT。就像它的家族成員白喉毒素和霍亂毒素ー樣,它通過細(xì)胞延伸因子2的ADP-核糖基化來抑制蛋白質(zhì)合成。銅綠假單胞菌外毒素A作為單體存在，由613個(gè)氨基酸的單ー多肽鏈^6kd)組成。ETA可潛在地用作疫苗偶聯(lián)物。ETA的無毒性突變體已作為用于防御金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痕疾和傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhi)的疫苗接種的疫苗偶聯(lián)物進(jìn)行了研究。以足夠滿足不斷擴(kuò)大的需求的量來生產(chǎn)這些毒素已成為重大的挑戰(zhàn)。當(dāng)在常規(guī)蛋白質(zhì)過表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)時(shí)，由于降本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D·M·雷奧爾阿克，L·丘，H·金，H·W·塔爾伯特，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：菲尼克斯公司，
類型：
國(guó)別省市：
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