本發明專利技術是基于１１Ｅ１０抗體在Ｓｔｘ２蛋白中的表位的發現。本發明專利技術的特征在于組合物，其含有包含１１Ｅ１０單克隆抗體表位的非全長Ｓｔｘ２多肽。本發明專利技術的特征還在于生產抗－Ｓｔｘ２抗體的方法，所述抗－Ｓｔｘ２抗體對Ｓｔｘ２蛋白的１１Ｅ１０表位是特異性的。另外，本發明專利技術的特征在于使用包含１１Ｅ１０表位的多肽或使用通過本發明專利技術的方法開發出的抗－Ｓｔｘ２抗體治療具有志賀毒素相關疾病（例如，溶血性尿毒癥綜合征和與大腸桿菌和痢疾志賀氏菌感染有關的疾病）或處于發展所述疾病風險中的受試者的方法。此外，本發明專利技術的特征在于使用通過本發明專利技術的方法開發出的抗體對樣品中Ｓｔｘ２的檢測。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
一般而言，本專利技術涉及治療和預防志賀毒素(Shiga toxin)相關疾病的領域。
技術介紹
在美國，生成志賀毒素(Mx)的大腸桿菌(STEC)每年造成約110，000例感染。腸出血性大腸桿菌(EHEC)(最顯著地是血清型0157:H7)是被發現產生Stx介導的疾病的 STEC的子集(subset)。生成Mx的生物體的感染的一種可能并發癥是溶血性尿毒癥綜合征(HUQ，其特征在于溶血性貧血、栓塞性血小板減少癥和腎衰竭。對于具有HUS的那些人而言，存在大約5-10%病死率，且幸存者可能具有持續的腎損傷。目前，沒有FDA批準的用于減輕或預防由Mx-介導的疾病引起的疾病的療法或疫苗，但是幾個在將來有前途的選擇包括結合和中和的人源化的單克隆抗體，和嵌合的ΜχΑ2/ΜχΒ1類毒素，其引起中和應答并提供對Mxl或或Mxl和Stx2的致死攻擊(challenge)的保護。基本上存在Mx的2個主要類型Α χ/Μχ 和Mx2。Mx由痢疾志賀氏菌 (Shigella dysenteriae) 1型生成，而Stxl和Stx2由大腸桿菌生成。Stx和Stxl基本上相同，僅在A亞基中存在1個氨基酸差異。Mxl和的成熟的A和B亞基分別具有68%和 73%相似性。盡管存在氨基酸序列差異，Stx和的晶體結構非常類似(圖1)。通過多克隆抗血清可以辨別這些毒素針對Mxl產生的多克隆抗血清不會中和Mx2，反之亦然。 存在 Stxl 和 Stx2 的變體，包括 Stxlc、MxlcUtx2c、Mx2cUtx2d-可活化的(Stx2_act.)、 Stx2e 和 Stx2f0志賀毒素是具有AB5結構的復雜的全毒素。活性結構域(A)含有將60S核糖體亞基的^S rRNA脫嘌呤化的N-糖苷酶，其終止蛋白合成，并最終導致細胞死亡。A亞基是 32kDa，且被胰蛋白酶(trypsin)或弗林蛋白酶(furin)蛋白水解性地切割成 ^kDa A1亞基和 5kDa A2肽，它們通過單個二硫鍵相連。A1亞基含有活性結構域，且A2肽將該活性結構域非共價地連接到結合(B)結構域上。(B)結構域由5個相同的 7. 7kDa單體組成，所述單體形成五聚體，A2肽的C-端貫穿該五聚體。B亞基單體中的每一個具有2個半胱氨酸殘基，它們在每個單體內形成二硫鍵。B五聚體結合真核受體三聚己糖神經酰胺(三己糖基神經酰胺，globotriaosyl ceramide) (Gb3)(或 Gb4,如對于 Stx2e 的情況)。盡管已知暴露于這些毒素的結果，目前尚不存在對Mx-介導的疾病的已知治療或疫苗。抗生素的使用可能通過增加細菌的毒素釋放而加重該情況。因而，需要預防或治療由志賀毒素造成的EHEC感染的并發癥的化合物。這樣的化合物可以用于治療受感染的受試者，并減少毒素對中樞神經系統(CNS)、血液和腎的系統性作用。另外，如果可以中和毒素，可以安全地給予抗生素，以殺死胃腸(GI)道中的細菌。由于抗生素通過誘導攜帶毒素基因的噬菌體而增加毒素生成的可能性，STEC感染的抗生素治療被禁忌。這樣的化合物也可以用于預防感染的并發癥，其通過在個體獲得EHEC感染之前治療暴露的或高危的個體而進行。這樣的個體將包括日間住院醫療的兒童或在醫護療養所中的老年人，該處已經鑒別出EHEC腹瀉的病例。這些個體處于發展EHEC感染的高危中，經常具有嚴重的并發癥，且EHEC在這些環境中的傳播并不罕見。
技術實現思路
單克隆抗體11E10會識別的A亞基，并中和它的細胞毒性。盡管MxAl和 MxA2之間存在68%氨基酸(aa)序列相似性，11E10單克隆抗體不會結合MxAl。我們已經發現，11E10表位包括跨MxA2單體上的3個區域的不連續的或構象的表位。發現3個不同性區域在Stx2A亞基的晶體結構上的位置彼此鄰近，所述3個不同性區域包括氨基酸 42-49 (SEQ IDNO 1) ,96-100 (SEQ ID NO 2)和 244-259 (SEQ ID NO :3)。因此，我們已經發現，11E10表位包括以SEQ ID NO :1、2和3示出的序列中的至少1個、2個或所有3個。因此，本專利技術的特征在于一種多肽，其包括在SEQ ID N0:l、2和3中所述的氨基酸序列的至少1個、2個或3個，其中所述多肽不是全長Mx2。所述多肽至少包括在SEQ ID NO 1中所述的氨基酸序列。理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO :1和2中所述的氨基酸序列，或更理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO :1、2和3中所述的氨基酸序列。在一個實施方式中，在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列的一個或多個被插入非-Stx2蛋白支架(protein scaffold)中。在某些實施方式中，所述蛋白支架是與Mxl或其片段基本上相同的蛋白， 例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%相同。在一個實施方式中，所述蛋白支架是^^、Stx或攜帶一個或多個保守點(位點，point)突變的 Mxl。在另一個實施方式中，本專利技術的多肽包括與在SEQ ID NO :8中所述的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。在另一個實施方式中，所述多肽可以包括的片段，其包括SEQ ID N0:l、2或3;SEQ ID NO :1和2;或SEQ ID NO :1、2和3，例如，Stx2多肽序列的氨基酸四-297、氨基酸1-158或氨基酸，其中所述片段不是全長Mx2。在有些實施方式中， 所述片段被插入蛋白支架(例如，Stx或Mxl)中。本專利技術的特征還在于一種多肽，其包括與在SEQ ID NO :8中所述的氨基酸序列的片段基本上相同的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述片段包括與SEQ ID NO :8的氨基酸 64-122 至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 相同的序列，且另外至少包括在SEQ ID NO :1中所述的氨基酸序列。優選地，所述片段另外包含在SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :2和3中所述的(一個或多個)氨基酸序列。所述片段的長度可以是，例如，20、40、59、60、150、200、219、236、250、300或314個氨基酸。在某些實施方式中，所述多肽被類毒素化。所有上述多肽都被包括在術語“本專利技術的多肽”內。本專利技術也包括編碼任一種本專利技術的多肽的核酸分子，包括其中所述核酸被連接到載體中的表達構建體上，且其中該載體被插入宿主細胞中。在一個有關的方面，本專利技術的特征在于一種用于使用任一種本專利技術的多肽刺激針對的免疫應答的組合物。理想地，所述多肽包括在SEQ IDNO :1和2中所述的序列，或更理想地，所述多肽包括在SEQ ID N0:l、2和3中所述的序列。在這些實施方式的任一個中，所述組合物可以另外包括佐劑(adjuvant)。在某些實施方式中，所述組合物不會刺激針對Mxl的免疫應答。本專利技術的特征還在于任一種本專利技術的多肽(例如，蛋白支架如Stxl，其插入了在 SEQ ID N0:l、2或3中的至少1個、2個或所有3個中所述的氨基酸序列)的應用。這樣的肽可以用于針對任意志賀毒素有關的疾病進行免疫或治療，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．一種用于刺激針對Ｓｔｘ２的免疫應答的組合物，所述組合物包含藥學上可接受的載體和至少一種純化的多肽，所述多肽包含：（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１和２；或（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２和３；以及非－Ｓｔｘ２蛋白支架，其中，所述ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１和２、或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２和３插入到所述非－Ｓｔｘ２蛋白支架中，其中，所述多肽具有Ｓｔｘ２的抗原性。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：艾利森·奧博萊，
申請(專利權)人：杰克孫M亨利基金會先進軍事醫學有限公司，
類型：發明
國別省市：US
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