本發明專利技術涉及海洋生物技術領域，具體的說是一種分離純化沙蜇毒素內溶血毒素蛋白的方法。其分離方法如下：沙蜇刺絲囊細胞經超聲破碎提取得到水母粗毒素，透析除鹽后先后依次經過陰離子和凝膠過濾色譜層析分離純化，最終得到一種具有溶血活性的水母毒素蛋白，并且測定其半溶血率約為70μg/mL，分子量約為450kDa。本發明專利技術具快速、簡便的特點，為獲得沙蜇毒素溶血毒素蛋白提供了重要的方法指導。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物技術，具體的說是一種從沙蜇(Stomolophus meleagris L. Agassiz)刺絲囊細胞毒素中分離純化溶血毒素蛋白的方法。
技術介紹
水母(jellyfish)是一種膠質狀的浮游動物，主要包括四大類群刺胞動物門的水螅水母類、管水母類、缽水母類以及櫛水母門的櫛水母類。水母種類繁多，分布廣泛， 世界上已記錄的水母種類大約有1000種左右，其中我國海域已知的約有400種。我國是海岸線非常長的國家之一，從北到南地跨寒溫帶、溫帶、亞熱帶和熱帶，而在我國的沿海地區幾乎均有大量水母分布，其中以沙蜇數量尤為豐富。沙蜇(Stomolophus meleagris L. Agassiz)，是大型缽水母，傘徑180-980mm。隸屬于腔腸動物門(Coelenterata)，缽水母綱(^cyphomedusae)，根口水母目(Rhizostomeae), 口冠水母科(Stomolophidea)，口冠水母屬(Stomolophus)。近年來，水母經常暴發，造成眾多游泳者被蜇傷，輕者皮膚出現皮疹、 紅腫、瘙癢，令被蜇傷者痛苦不堪，重者昏厥、休克甚至死亡。而水母之所以能夠給人們帶來如此大的危害，最主要的原因是存在于水母觸手上的刺絲囊細胞內含有大量的水母毒素。 水母毒素主要是蛋白類物質，其中包含多種具有不同生物活性的毒素蛋白，如溶血活性、酶活性、抗氧化活性、致死毒性、心臟血管毒性、肝臟毒性等，而水母毒素作為一類結構新穎的蛋白，為開發新型的海洋藥物提供了重要的先導化合物。但是，到目前為止對水母毒素的研究主要集中在水母粗毒方面，其主要原因有以下幾方面第一，水母粗毒素中含有許多種蛋白組分，其中某些組分之間的性質(如分子量、帶電荷數、疏水性等)非常相近，這就給水母毒素的分離純化帶來了很大的麻煩；第二， 水母毒素是蛋白類物質，具有熱敏感性，容易受到溫度等環境因素的影響而致使其活性降低甚至喪失，這就造成在分離純化過程中很難保持其活性。第三，水母種類的不同，其生理結構以及體內所含的毒素成分和活性也存在較大的差異，這就致使不同種類水母毒素的分離純化工作難以直接效仿，只能通過繁雜的實驗摸索才能獲得。所以，水母毒素的分離純化工作具有很大的難度。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為一種從沙蜇刺絲囊毒素中分離溶血毒素蛋白的方法，1)將處理后的沙蜇刺絲囊細胞上清液經微孔濾膜過濾，濾液經含DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，采用洗脫液以UmLmirT1流速進行純化分離，收集洗脫液在低溫下用3 漲的超濾管進行濃縮，待用；所述洗脫液為含不同濃度NaCl的磷酸緩沖液，NaCl 濃度分別為0,0. 1,0. 2,0. 3和2M ；收集采用含0. 2M NaCl的磷酸緩沖液洗脫下的組分；2)將上述所得洗脫組分經微孔濾膜過濾，濾液經凝膠色譜柱SuperdeUOO采用0. 15M NaCl，10 50mM，pH7. OPBS緩沖液以0. 2 1. OmLmirT1流速進行分離純化，收集洗脫體積處于60 SOmL的洗脫液，而后在2 6°C下用3 漲的超濾管進行濃縮，濃縮后即得到從沙蜇刺絲囊毒素中分離溶血毒素蛋白。所述處理后的沙蜇刺絲囊細胞上清液將沙蜇刺絲囊細胞加入預冷緩沖液中破碎，破碎后2 6°C離心，收集上清液于2 6°C下用磷酸緩沖液透析過夜，然后低溫離心， 收集上清液，待用。所述沙蜇刺絲囊細胞將置于-80 -20°c低溫的沙蜇觸手于2 6°C自溶12 48h，自溶后利用20 60目的標準分樣篩濾去觸手殘片，而后在2 6°C下10000 15000g 離心5 20min，收集下部沉淀，2 6°C冷凍干燥，待用。所述沙蜇刺絲囊細胞加入pH7. 0，濃度10 30mM的2 6°C下預冷磷酸緩沖液中，而后將其置于冰浴下用超聲波功率為200 400kw下破碎20 60min中，工作/間隙為k/30s ；所述收集上清液于2 6°C下用pH7. 0，濃度10 30mM磷酸緩沖液透析過夜。所述采用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱進行分離純化，其中洗脫液為含不同濃度NaCl的磷酸緩沖液，即洗脫液為OM NaCl的pH7. 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)、0. IM NaCl 的 ρΗ7· 0，濃度 10 30mM 的磷酸緩沖液(PBS)、0· 2M NaCl 的 ρΗ7· 0， 濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)、0. 3M NaCl的pH7. 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液 (PBS)和2M NaCl的ρΗ7· 0，濃度10 30mM的磷酸緩沖液(PBS)。所述微孔濾膜過濾為采用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾。本專利技術的優點1.本專利技術從沙蜇毒素中分離純化溶血毒素蛋白的方法，為水母毒素蛋白的純化提供了方法指導。2.本專利技術采用陰離子交換樹脂DEAE Sepharose Fast Flow和凝膠過濾樹脂 SuperdeX200分離溶血毒素蛋白，具有流速快、分辨率高、產率高的特點，而且分離步驟少， 只經過兩步柱層析分離就能夠得到較純的溶血毒素蛋白，有效地縮短了分離時間，減少了溶血毒素蛋白的活性損失。附圖說明圖1為本專利技術實施例提供的陰離子交換樹脂DEAE Sepharose Fast Flow分離沙蜇毒素的分步洗脫層析圖。圖2本專利技術實施例提供的凝膠過濾樹脂SuperdeX200分離上一步中溶血組分的洗脫層析圖。圖3分離到的溶血蛋白的非變性電泳圖片。圖4分離到的溶血蛋白的溶血梯度圖具體實施例實施例1 1)沙蜇毒素刺絲囊細胞的制備將Ikg冰凍的沙蜇觸手于2°C下自溶過夜后，用濾篩過濾去除沙蜇觸手殘片，收集上清液倒掉。然后1000g，2°C下冷凍高速離心5min并收集下層沉淀，用生理鹽水(0. 154mol - L-1NaCl溶液)于4°C反復洗滌3次至上層液澄清，并將刺絲囊細胞沉淀冷凍干燥后，-20°C下冷凍保存備用。2)沙蜇毒素的提取稱取沙蜇刺絲囊細胞5mg，加入20mL pH7. 0，IOmM在2°C下預冷的磷酸緩沖液中，而后將其置于冰浴中用超聲波功率為200kw下破碎20min中，工作/間隙為5s/30s。然后2°C, IOOOOg離心5min待用。3)陰離子交換樹脂DEAE Sepharose Fast Flow分離沙蜇毒素①上樣前樣品的預處理取上述提取到的沙蜇毒素于2。C pH7. 0，IOmM磷酸緩沖液中透析過夜，然后2°C下IOOOOg離心5min，取上清，用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，待用。②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上DEAE Sepharose Fast Flow陰離子柱，分離時采用分步洗脫，流速為ImLmirT1，洗脫液分別為0、0. 1、0. 2、0. 3和2M NaCl的pH7.0，濃度IOmM的磷酸緩沖液(PBS)，然后收集溶血組分即收集0. 2M NaCl的洗脫液(參見圖1)。4)凝膠過濾交換樹脂SuperdeX200分離上一步中溶血組分①上樣前樣品的預處理將上步分離得到的溶血組分在2°C用I超濾管濃縮后用孔徑為0. 45 μ m的微孔濾膜過濾，待用。②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上凝膠過本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李鵬程，李榮鋒，于華華，邢榮娥，劉松，秦玉坤，李克成，李冰，孟祥濤，崔金會，
申請(專利權)人：中國科學院海洋研究所，
類型：發明
國別省市：
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