重組歐氏桿菌天冬酰胺酶的生產方法技術

本文提供了生產重組歐氏桿菌天冬酰胺酶的方法。本文的方法生產在宿主細胞的周質或細胞質中具有高表達水平的天冬酰胺酶，其活性與可商購的天冬酰胺酶制劑相當。

Production method of recombinant asparaginase

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】重組歐氏桿菌天冬酰胺酶的生產方法相關申請的交叉引用本申請要求2017年10月27日提交的美國臨時申請號62/578,305的權益，其通過引用并入本文。序列表本申請包含序列表，其已經以ASCII格式電子提交，并且通過引用整體并入本文。所述ASCII副本創建于2018年10月16日，文件名為38194-749_601_SL.txt，大小為71,228字節。
技術介紹
來自細菌菊歐氏桿菌的L-天冬酰胺酶II型(也稱為菊天冬酰胺酶(crisantaspase))被指出與其他化療劑聯合用于治療急性淋巴細胞白血病(ALL)的患者，其已發展出針對源自大腸桿菌的天然或聚乙二醇化的天冬酰胺酶的超敏反應或沉默失活。它也可用于治療其他腫瘤性疾病。菊天冬酰胺酶是通過發酵菊歐氏桿菌以產生細胞糊狀物而制備，細胞糊狀物經過處理以產生酶制劑，該酶制劑通過一系列色譜法和其他方法進一步純化以產生藥物。當在歐氏桿菌中表達時，菊天冬酰胺酶前蛋白利用其在N-末端存在的天然分泌信號序列分泌到細胞的周質空間。一旦定位在周質空間內，信號序列被切割掉以產生能夠自發地融合成四聚體或或活性形式的菊天冬酰胺酶的成熟單體。在某些情況下，使用具有來自異源的各種分泌信號肽的融合體，在大腸桿菌中表達重組菊天冬酰胺酶。
技術實現思路
本文提供了用于生產重組II型天冬酰胺酶的方法。在一些實施方式中，該方法包括：在培養基中培養假單胞菌目(Pseudomonadales)宿主細胞并從包含編碼所述重組天冬酰胺酶的核酸的表達構建體在所述假單胞菌目宿主細胞的細胞質中表達所述重組天冬酰胺酶，其中所述重組天冬酰胺酶在所述細胞質中以約20％TCP至約40％TCP可溶天冬酰胺酶的產率產生。在一些實施方式中，重組天冬酰胺酶在細胞質中以約10g/L至約25g/L的產率產生。在一些實施方式中，該方法進一步包括使用活性試驗測量所產生的一定量的可溶重組II型天冬酰胺酶的活性。在一些實施方式中，編碼重組天冬酰胺酶的核酸被優化用于在宿主細胞中表達。在一些實施方式中，重組天冬酰胺酶是菊歐氏桿菌L-天冬酰胺酶II型(菊天冬酰胺酶)。在一些實施方式中，編碼重組天冬酰胺酶的核酸包含與SEQIDNO:1至少85％同源的序列。在一些實施方式中，重組天冬酰胺酶具有與SEQIDNO:2至少85％同源的氨基酸序列。在一些實施方式中，重組天冬酰胺酶的表達通過向培養基中添加IPTG來誘導。在一些實施方式中，IPTG在培養基中的濃度為約0.05mM至約2.5mM。在一些實施方式中，當假單胞菌(Pseudomonad)宿主細胞已生長至約0.1g/g至約0.5g/g的濕細胞重量時，誘導重組天冬酰胺酶的表達。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞在約5.0至約8.0的pH下培養。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞在22℃至約33℃的溫度下培養。在本文的任何實施方式中，假單胞菌目宿主細胞是熒光假單胞菌細胞。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞缺乏一種或多種天冬酰胺酶的表達。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞缺乏一種或多種天然天冬酰胺酶的表達。在一些實施方式中，缺乏表達的天然天冬酰胺酶是I型天冬酰胺酶。在一些實施方式中，缺乏表達的天然天冬酰胺酶是II型天冬酰胺酶。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞缺乏一種或多種蛋白酶的表達。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞過表達一種或多種折疊調節體。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞缺乏一種或多種天然天冬酰胺酶的表達，缺乏一種或多種蛋白酶的表達和/或過表達一種或多種折疊調節體。在實施方式中，該方法包括：在培養基中培養假單胞菌目宿主細胞并從包含編碼重組天冬酰胺酶的核酸的表達構建體在假單胞菌目宿主細胞的周質中表達所述重組天冬酰胺酶；其中所述重組天冬酰胺酶在所述周質中以約20％至約40％TCP可溶天冬酰胺酶(例如單體天冬酰胺酶)的產率產生。在一些實施方式中，重組天冬酰胺酶在周質中以約5g/L至約20g/L的產率產生。在一些實施方式中，該方法進一步包括使用活性試驗測量所產生的一定量的重組II型天冬酰胺酶的活性。在一些實施方式中，編碼重組天冬酰胺酶的核酸被優化用于在宿主細胞中表達。在一些實施方式中，重組天冬酰胺酶是菊歐氏桿菌L-天冬酰胺酶II型(菊天冬酰胺酶)。在一些實施方式中，編碼重組天冬酰胺酶的核酸包含與SEQIDNO:1至少85％同源的序列。在一些實施方式中，重組天冬酰胺酶具有與SEQIDNO:2至少85％同源的氨基酸序列。在一些實施方式中，重組天冬酰胺酶的表達通過向培養基中添加IPTG來誘導。在一些實施方式中，IPTG在培養基中的濃度為約0.05mM至約2.5mM。在一些實施方式中，當假單胞菌目宿主細胞已生長至約0.05g/g至約0.5g/g的濕重量時，誘導重組天冬酰胺酶的表達。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞在約5.0至約8.0的pH下培養。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞在22℃至約33℃的溫度下培養。在一些實施方式中，假單胞菌宿主細胞是熒光假單胞菌細胞。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞缺乏一種或多種天然天冬酰胺酶的表達。在一些實施方式中，缺乏表達的天然天冬酰胺酶是I型天冬酰胺酶。在一些實施方式中，缺乏表達的天然天冬酰胺酶是II型天冬酰胺酶。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞缺乏一種或多種蛋白酶的表達。在一些實施方式中，假單胞菌目宿主細胞過表達一種或多種折疊調節體。在一些實施方式中，表達構建體包含分泌前導體。在一些實施方式中，分泌前導體選自假單胞菌目分泌前導體FlgI、Ibps31A、PbpA20V、DsbC、8484和5193。在一些實施方式中，分泌前導體指導所產生的重組天冬酰胺酶轉移至假單胞菌宿主細胞的周質。在一些實施方式中，該方法進一步包括使用相同的活性試驗將產生的重組II型天冬酰胺酶的測量的活性與相同量的對照II型天冬酰胺酶的測量的活性進行比較。在一些實施方式中，對照II型天冬酰胺酶包含已在至少一個國家被商業批準用于患者的歐氏桿菌II型天冬酰胺酶。在一些實施方式中，當產生的重組II型天冬酰胺酶具有II型天冬酰胺酶對照樣品的約80％至約120％的活性時，選擇所述產生的重組II型天冬酰胺酶用于患者。在一些實施方式中，重組II型天冬酰胺酶被修飾以增加在患者中的半衰期。在實施方式中，宿主細胞選自以下中的至少一種：缺乏HslUV蛋白酶的宿主細胞、缺乏PrtB蛋白酶的宿主細胞、缺乏Prc蛋白酶的宿主細胞、缺乏DegP蛋白酶的宿主細胞、缺乏AprA蛋白酶的宿主細胞、缺乏Lon蛋白酶的宿主細胞、缺乏La蛋白酶的宿主細胞、缺乏DegP1的宿主細胞、缺乏DegP2的宿主細胞和過表達DegPS219A的宿主細胞。通過引用并入本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請都以如同每個單獨的出版物，專利或專利申請被明確地并單獨地指出通過引用并入的相同程度通過引用并入本文。附圖說明在所附權利要求中具體闡述了本公開的新穎特征。通過參考以下闡述在其中利用了本公開的原理的說明性實施例的詳細描述并結合附圖，將獲得對本公開的特征和優點的更好的理解：圖1.SDS-CGE凝膠樣圖像本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種用于生產重組II型天冬酰胺酶的方法，所述方法包括在培養基中培養假單胞菌目宿主細胞并從包含編碼所述重組II型天冬酰胺酶的核酸的表達構建體在所述假單胞菌目宿主細胞的細胞質中表達所述重組II型天冬酰胺酶，其中所述重組天冬酰胺酶在所述細胞質中以約20％TCP至約40％TCP可溶II型天冬酰胺酶的產率產生。/n

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】20171027 US 62/578,3051.一種用于生產重組II型天冬酰胺酶的方法，所述方法包括在培養基中培養假單胞菌目宿主細胞并從包含編碼所述重組II型天冬酰胺酶的核酸的表達構建體在所述假單胞菌目宿主細胞的細胞質中表達所述重組II型天冬酰胺酶，其中所述重組天冬酰胺酶在所述細胞質中以約20％TCP至約40％TCP可溶II型天冬酰胺酶的產率產生。


2.根據權利要求1所述的方法，其中所述重組II型天冬酰胺酶在所述細胞質中以約10g/L至約25g/L的產率產生。


3.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括使用活性試驗測量所產生的一定量的所述可溶重組II型天冬酰胺酶的活性。


4.根據權利要求1所述的方法，其中所述重組II型天冬酰胺酶是菊歐氏桿菌L-天冬酰胺酶II型(菊天冬酰胺酶)。


5.根據權利要求1所述的方法，其中編碼所述重組II型天冬酰胺酶的所述核酸包含與SEQIDNO:1至少85％同源的序列。


6.根據權利要求1所述的方法，其中所述重組II型天冬酰胺酶具有與SEQIDNO:2至少85％同源的氨基酸序列。


7.根據權利要求1所述的方法，其中所述假單胞菌目宿主細胞是熒光假單胞菌細胞。


8.根據權利要求1所述的方法，其中所述宿主細胞缺乏一種或多種天然天冬酰胺酶的表達。


9.根據權利要求8所述的方法，其中所述一種或多種缺乏表達的天然天冬酰胺酶選自：I型天冬酰胺酶；II型天冬酰胺酶；及其組合。


10.根據權利要求1所述的方法，其中所述宿主細胞：缺乏一種或多種蛋白酶的表達；過表達一種或多種折疊調節體；或兩者。


11.一種用于生產重組II型天冬酰胺酶的方法，所述方法包括：
在培養基中培養假單胞菌目宿主細胞并從包含編碼所述重組II型天冬酰胺酶的核酸的表達構建體在所述宿主細胞的周質中表達所述重組II型天冬酰胺酶，其中所述重組II型天冬酰胺酶在所述周質中以約20％至約40％TCP可溶天冬酰胺酶的產率產生。


12.根據權利要求11所述的方法，其中所述重組II型天冬酰胺酶在所述周質中以約5g/L至約30g/L的產率產生。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：R·J·科爾曼，T·布魯克，
申請(專利權)人：菲尼克斯公司，
類型：發明
國別省市：美國;US