本發(fā)明專利技術涉及在細菌宿主中生產重組蛋白的領域。其進一步涉及不使用變性和不需要重折疊步驟而從不溶性部分提取可溶性的活性重組蛋白。特別是，本發(fā)明專利技術涉及用于從細菌宿主獲得高水平的可溶性重組1型干擾素蛋白的制備方法。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】優(yōu)先權聲明本申請根據35U.S.C. § 119(e)要求于2010年3月4日提交的美國專利申請序列號61/310，671的優(yōu)先權。美國專利申請序列號61/310，671的內容在此通過引用全文并入。 序列表本申請包含通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，該序列表在此通過引用整體并入本文。創(chuàng)建于2011年2月11日的所述ASCII拷貝被命名為38194601(2). txt，且大小為9，237字節(jié)。
技術介紹
許多異源重組蛋白在細菌系統(tǒng)中表達時以錯折疊的不溶性形式(稱為包涵體)產生。一般地，必須使用變性試劑以溶解包涵體中的重組蛋白。然后該蛋白必須在已對于蛋白質的適當折疊進行優(yōu)化的條件下復性。在優(yōu)化上花費的努力以及緩慢的重折疊過程和降低的過程產率增加了重組蛋白生產的成本和時間。干擾素表現出抗病毒、抗增殖、免疫調節(jié)和其它活性。幾種不同類型的人干擾素(包括α、β和Y)已基于例如其抗病毒和抗增殖活性進行區(qū)分。干擾素的分泌通過信號(包括病毒、雙鏈RNA、其它多核苷酸、抗原和有絲分裂原)誘導。干擾素_β是已在細菌中以重組形式表達的蛋白質的實例，其中它隔離在包涵體中。人干擾素-β Ib是分子量為約22kDa和由165個氨基酸殘基組成的調節(jié)性多肽。它可以由機體中的許多細胞(特別是成纖維細胞)響應于病毒感染或對其它生物物質的暴露而產生。它結合多聚的細胞表面受體。產生性的受體結合導致細胞內事件的級聯，從而導致干擾素_β誘導基因的表達和觸發(fā)抗病毒、抗增殖和免疫調節(jié)活性。干擾素_β lb,具體地說Betaseron (h-IFN-β Ib C17S),已經被用于治療疾病，包括多發(fā)性硬化(MS)、乙型肝炎和丙型肝炎感染、神經膠質瘤和黑素瘤。干擾素-β已經證明減少患有復發(fā)的和緩解的MS的患者遭受侵襲的次數。需要大量的干擾素_β Ib用于治療用途。重組干擾素Ib已在哺乳動物細胞中以低水平生產，包括人成纖維細胞和CHO細胞。動物細胞表達通常受到包括更長的處理時間、容易發(fā)生培養(yǎng)物的污染、需要維持嚴格的培養(yǎng)條件和高昂的培養(yǎng)基成本的技術難題的阻礙。由于已發(fā)現糖蛋白成分一般對于干擾素β的活性不是必須的，研究已經轉向在細菌表達系統(tǒng)(大腸桿菌)中表達重組蛋白。如已經注意到的，在大腸桿菌中生成的包涵體必須通過變性溶解，且干擾素β必須重折疊。重折疊(其為緩慢的)延長了處理時間、增加了成本且降低了產率。目前為止，用于在哺乳動物或細菌宿主細胞中快速和經濟地產生高水平的可溶性重組干擾素-β而無需變性和重折疊步驟的方法尚未見描述。專利技術概述本專利技術涉及用于在熒光假單胞菌中表達干擾素和開發(fā)使用溫和去垢劑和無需重折疊過程而從發(fā)酵產物提取活性蛋白的方法。特別地，本專利技術提供了用于產生重組I型干擾素蛋白的方法，所述方法包括通過培養(yǎng)包含表達構建體的假單胞菌或大腸桿菌宿主細胞表達重組干擾素蛋白，該表達構建體包含已經針對在所述宿主細胞中表達而優(yōu)化的編碼序列；裂解所述宿主細胞；從所述裂解步驟獲得不溶性部分和可溶性部分；通過使所述不溶性部分經歷非變性提取條件而對其進行提取；和從所述不溶性部分獲得提取沉淀和提取上清液，其中在所述提取上清液中的重組蛋白以可溶性形式、活性形式或其組合形式存在而無需進一步進行復性或重折疊步驟。在實施方式中，所述非變性提取條件包括存在溫和去垢劑。在某些實施方式中，所述溫和去垢劑是兩性離子去垢劑。在特定實施方式中，所述兩性離子去垢劑是Zwittergent3-08、Zwittergent 3-10、Zwittergent3_12 或 Zwittergent 3-14。在實施方式中，所述非變性提取條件包括約O. 5%至約2%的Zwittergent 3_14。在某些實施方式中，所述溫和去垢劑不是N-月桂酰基-肌氨酸(NLS)。在實施方式中，所述非變性提取條件包括溫和去垢劑的存在且進一步包括離液劑和親液鹽(cosmotropic salt)。在某些實施方式中，所述離液劑是尿素或鹽酸胍,和所述親液鹽是NaCl、KCl或(NH4) 2S04。在特定實施方式中，所述非變性提取條件包括約O. 5至約2%的Zwittergent3_14 ;約O至約2M的尿素；約O至約2M的NaCl ;且pH為約6. 5至約·8.5。在實施方式中，所述非變性提取條件包括約1%的ZWittergent3-14 ；2M的尿素；2M的NaCl ;且pH為約8. 2。在其它實施方式中，所述非變性提取條件還包括約1%至約40%w/v的固形物。在某些實施方式中，所述非變性提取條件還包括約5% w/v的固形物。在實施方式中，所述重組I型干擾素蛋白是干擾素-β、干擾素-α、干擾素-K、干擾素-τ或干擾素_ω。在特定實施方式中，所述重組I型干擾素蛋白是干擾素_β或干擾素-α。在實施方式中，所述重組I型干擾素蛋白是干擾素_β，且所述干擾素選自 人干擾素-Plb和人干擾素-β Ib C17S。在實施方式中，其中所述重組I型干擾素蛋白是干擾素-α，且所述干擾素-α選自人干擾素-a 2a和人干擾素-α 2b。在進一步的實施方式中，所要求保護的方法進一步包括測量所述不溶性部分和所述提取上清液部分中重組I型干擾素蛋白的量，其中所述提取上清液部分中檢測的重組干擾素蛋白的量為所述不溶性部分中檢測的重組干擾素蛋白的量的約10%至約95%。在其它實施方式中，所述方法進一步包括測量所述重組蛋白的活性，其中所述提取上清液部分中存在的重組蛋白的約40%至約100%測定為活性的。在相關的實施方式中，所述重組蛋白是干擾素_β，且所述活性重組蛋白的量通過Blue S印harose親和柱層析、受體結合分析、抗病毒活性分析或細胞病變效應分析測定。在其它實施方式中，所述重組蛋白是干擾素-α、干擾素-K或干擾素_ω，且所述活性重組蛋白的量通過Blue Sepharose親和柱層析、受體結合分析、抗病毒活性分析或細胞病變效應分析測定。本專利技術進一步提供了用于產生重組I型干擾素蛋白的方法，所述方法包括通過培養(yǎng)包含表達構建體的假單胞菌或大腸桿菌宿主細胞表達重組干擾素蛋白，該表達構建體包含已經針對在所述宿主細胞中表達而優(yōu)化的編碼序列；裂解所述宿主細胞；從所述裂解步驟獲得不溶性部分和可溶性部分；通過使所述不溶性部分經歷非變性提取條件而對其進行提取；和從所述不溶性部分獲得提取沉淀和提取上清液，其中在所述提取上清液中的重組蛋白以可溶性形式、活性形式或其組合形式存在而無需進一步進行復性或重折疊步驟，其中所述重組蛋白是干擾素-β，且進一步其中所述非變性提取條件使用圖4B中的信息優(yōu)化。在實施方式中，所述提取上清液中的重組蛋白以約O. 3克每升至約10克每升的濃度存在。在其它實施方式中，所述宿主細胞在約I至20或更多升的體積中培養(yǎng)。在特定的實施方式中，所述宿主細胞在約I升、約2升、約3升、約4升、約5升、約10升、約15或約20升的體積中培養(yǎng)。在一個實施方式中，所述表達構建體包含誘導型啟動子。在特定的實施方式中，所述表達構建體包含Iac啟動子衍生物且干擾素的表達通過IPTG誘導。在實施方式中，所述宿主細胞生長于約25°C至約33°C的溫度下，約5. 7至約6. 5的pH下，且當OD575達到約80至約160時添加IPTG達到約O. 08mM至約O.本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：J·艾倫，馮平華，A·帕特卡，K·L·黑尼，L·丘，L·L·P·森錢薩朗希，
申請(專利權)人：菲尼克斯公司，
類型：
國別省市：
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